Изучение онкометаболитов, характерных для тканей головного мозга, с помощью методов масс-спектрометрии

Актуальность

В последние десятилетия методы масс-спектрометрии начали широко применяться в различных областях медицинской практики: токсикологии, фармакокинетике, а также областях медицинских исследований: протеомике, метаболомике, липидомике. За рубежом активно развивается метод исследования онкометаболитов. Развитие существующих методов с целью быстрого и объективного исследования тканей, основанных на методах масс-спектрометрии, является актуальной задачей. Для их реализации необходимо разрабатывать подходы к ионизации молекул, содержащихся в конкретном биологическом образце, а также методы анализы полученных данных.

Метод масс-спектрометрии может быть использован как альтернатива экстренной гистологии на операциях, так как он быстрее и объективнее, чем экстренная гистология, в связи с тем, что опирается на данные масс-спектра, а не только на визуальные характеристики.

Цель

Создание программы, с помощью которой происходит быстрая обработка данных, получаемых с помощью масс-спектрометра.

Задачи

1. Составление литературного обзора: выделение основных химических классов молекул тканей; выявление конкретных молекул, которые характерны для здоровых тканей и тканей с патологическими нарушениями; изучение принципов работы масс-спектрометра и технологии MALDI.

2. Ознакомление с существующими языками программирования, изучение функционала выбранного языка программирования Python.

3. Подготовка к эксперименту, расчёт концентраций необходимых реагентов, ознакомление с техникой безопасности.

4. Написание программы с использованием языка программирования Python для поиска веществ среди тех, которые выявил масс-спектрометр.

5. Проведение эксперимента, получение и обработка экспериментальных данных.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Аналитические весы Shimadzu

• Автоматические пипетки Eppendorf

• Аэрограф

• Масс-спектрометр ultrafleXtreme MALDI-TOF

Описание

Работа строилась на основе следующей гипотезы: можно выделить на базе литературного обзора основные классы и подклассы молекул (в частности, белки, жиры и др.), а также метаболиты (например, образующиеся в цикле Кребса) с целью определения здоровых тканей и тканей с патологическими нарушениями. На основании выбранных молекул можно проводить более экспрессный и объективный анализ, чем гистология, с помощью которого можно делать вывод об исследуемом образце.

На основании литературных данных была выбрана молекула L-2-гидроксиглутарат (148 г/моль), так как она чаще других упоминается как маркер опухолевой ткани и признана таковым маркером многими учёными. Изучена матрица – 9-аминоакридин (9-аа), которая используется для смягчения условий ионизации и предотвращает разрушение образца, которое могло бы в значительной степени усложнять процесс анализа данных. Рассчитаны массы веществ и объёмы необходимых растворов для нанесения подобранной матрицы для будущего эксперимента. Так как для корректной работы программы необходимо знать не только массу исходной молекулы, но также и массы фрагментов, которые образуются при действии лазера на образец, были составлены возможные пути фрагментации (разрушения) молекулы под действием лазера в приборе, исходя из соображений стабильности связей в молекуле, индуктивного и мезомерного эффектов. В процессе работы список дополнялся. Схема выполнена с помощью программы ChemDraw.

Были приготовлены: раствор 9-аминоакридина для нанесения на каждый из исследуемых образцов; два среза тканей мыши с раковой опухолью и здоровой мыши (предоставлены сотрудниками лаборатории МФТИ). Матрицу (9-аминоакридин) нанесли на металлический образец с помощью аэрографа и исследовали с помощью масс-спектрометра ultrafleXtreme MALDI-TOF.

Аэрограф и пластина с нанесённой матрицей

Результаты

1. Подобранная на основании литературного обзора молекула – L-2-гидроксиглутарат – может быть использована для определения вида ткани.

2. С помощью масс-спектрометра ultrafleXtreme MALDI-TOF получили спектры с двух образцов срезов тканей мышей. На графике зелёным показан срез ткани здоровой мыши, а красным – срез ткани мыши с опухолью. По оси У отложена интенсивность сигнала, а по оси Х отложено m/z.

Как видно из полученного графика, автоматически подписываются не все значения. Все значения можно посмотреть в текстовом файле, который выдаётся программой. Более того, обилие пиков очень усложняет анализ спектра, поэтому написанная программа, использующая текстовый файл, очень облегчает задачу.

3. Код состоит из двух фрагментов:

- преобразует данные, получаемые из масс-спектрометра в массив;

- считывает из этого массива число повторений масс фрагментов вещества после процесса фрагментации.

Фрагмент написанного кода

4. В образце ткани мыши с раковой опухолью были обнаружены все предложенные фрагменты, а в образце ткани мыши без раковой опухоли были обнаружены не все предложенные фрагменты, поэтому выбранная матрица (9-аминоакридин) подходит для выполнения исследований данного типа.

Выводы

Полное исследование с помощью масс-спектрометра и обработка данных с помощью программы занимает не более 20 минут, поэтому является перспективным методом для экспресс-диагностики как альтернатива экстренной гистологии.

Перспективы использования результатов работы

Полученные данные могут быть использованы для дальнейшего изучения других образцов тканей и фрагментов других веществ с такой же массой.

Сотрудничество с вузом при создании работы

МФТИ, лаборатория ионной и молекулярной физики.