Получение лизоцима – простейшего фермента, обладающего антибактериальной активностью. Использование в биотехнологии и медицине

Актуальность

Лизоцим – фермент, относящийся к классу гидролаз, который разрушает клеточные стенки бактерии путём гидролиза пептидогликана – муреина, поэтому лизоцим обладает противобактериальным действием. Бактериальные заболевания становятся всё более распространёнными в современном мире. Наряду с появляющимися каждый год новыми болезнями, угрозу также представляют мутации у старых возбудителей, которые ведут к приобретению устойчивости клеток к антибиотикам, поэтому крайне важно найти эффективное и как можно более универсальное средство против патогенных штаммов микроорганизмов. У лизоцима есть большой потенциал применения как в медицинской отрасли, так и в биотехнологии благодаря его лёгкой доступности для получения и отличной способности быстро разрушать клеточную стенку бактерий.

Цель

Найти эффективный способ получения лизоцима и его применения в повседневной жизни и практике.

Задачи

1. Выделить лизоцим из яичного белка куриного яйца.

2. Проверить антибактериальную активность лизоцима.

3. Проверить возможность использования лизоцима в качестве компонента зубных паст и ополаскивателей.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Колонка хроматографическая GE Healthcare SP HP 5 ml

• Программируемые насосы фирмы «Agilent»

• Нанофотометр фирмы «Implen»

• Буфер Tris-HCL pH 8,6; ополаскиватели «Colgate Plax Освежающая мята» и «Лесной бальзам»

• SDS-электрофорез белков

• Маркеры молекулярных масс фирмы «Bio-Rad»

Описание

В процессе выполнения данной работы автором был выделен фермент лизоцим по известной методике. Работа состояла из нескольких этапов.

1. Был отделён яичный белок от желтка с последующим смешиванием его с буфером Tris-HCl pH 8,6 в соотношении 1:5. Полученный раствор отфильтровали и подвергли обработке ультразвуком.

2. Подготовленный раствор наносили на предварительно промытую буфером Tris-HCl pH 8,6 хроматографическую колонку GE Healthcare SP HP 5 ml. В данных условиях колонка сохраняла отрицательный заряд, белок был заряжен положительно, а значит, должен был связаться с колонкой. Далее на колонку наносили лизоцим с последующим смывом с помощью буфера Tris-HCl pH 8,6 с дополнительным содержанием 1 М соли.

3. Собранный раствор белка с солью и без неё анализировали электрофорезом (предварительно измерив концентрацию проб нанофотометром), отобрав пробы с пиком поглощения белковых молекул 280 нм.

4. Чистоту выделенных проб определяли методом SDS-электрофореза белков в геле в течение 45 минут при 200 В с последующей окраской проб белков.

5. Ферментативную активность лизоцима проводили диск-диффузным методом. В качестве питательной среды была использована смесь из 4,5 г агар-агара и 7,5 г питательной среды Луриа Бертани, разведённая в 300 мл дистиллированной воды. Посев производили бактериями E. сoli в течение 24 часов при температуре 37 °С.

Результаты

1. В результате проведённой работы была получена электрофореграмма фракций, отобранных после ионообменной хроматографии. Цифрами обозначены значения молекулярных масс некоторых маркеров в кДа, стрелками – расположение лизоцима и овальбумина.

Очистить лизоцим за одну стадию не получилось, так как все фракции были загрязнены более высокомолекулярным белком – овальбумином.

Для получения более чистого лизоцима был использован метод гель-фильтрации.

2. Для анализа антибактериальной активности диск-диффузным методом использовали 6 чашек Петри: 1 – лизоцим; 2 – лизоцим + ополаскиватель № 1; 3 – лизоцим + ополаскиватель № 2; 4 – ополаскиватель № 1; 5 – ополаскиватель № 2; 6 – контроль, не содержал вещества.

Чашки Петри с нанесёнными на них дисками, пропитанными в лизоциме и других противобактериальных веществах

Все используемые вещества и их комбинации обладали противобактериальным действием. Несмотря на то что лизоцим в основном эффективно уничтожает грамположительные бактерии, он также проявил бактерицидную активность и в случае с грамотрицательными бактериями. Это означает, что лизоцим может быть потенциальным универсальным противобактериальным средством, особенно в комбинации с другими средствами гигиены.

Выводы

1. Добавление лизоцима к ополаскивателям для рта улучшает их противобактериальное действие.

2. Лизоцим может быть потенциальным универсальным противобактериальным средством, особенно в комбинации с другими средствами гигиены.

Сотрудничество с учреждением при создании работы

ФИЦ Биотехнологии РАН