Подбор оптимальных условий проведения ОТ/ПЦР для генов MAX и MAD с целью определения уровня экспрессии их мРНК

Цель

Выявить оптимальные условия проведения ОТ/ПЦР для генов MAX и MAD и определение уровня экспрессии их мРНК.

Описание

Факторы транскрипции (транскрипционные факторы) — белки, контролирующие процесс синтеза мРНК на матрице ДНК (транскрипцию) путём связывания со специфичными участками ДНК. Транскрипционные факторы выполняют свою функцию либо самостоятельно, либо в комплексе с другими белками. Они обеспечивают снижение или повышение константы связывания РНК-полимеразы с регуляторными последовательностями регулируемого гена.

Эукариотические факторы транскрипции реализуют механизм регуляции экспрессии генов комбинаторного типа. Молекулы факторов транскрипции обладают консервативными доменами, которые дают им возможность осуществлять высокоспецифические белок-белковые и белково-нуклеиновые взаимодействия. In vivo происходит объединение факторов транскрипции и других регуляторных белков в большие регуляторные комплексы. Каждое новое сочетание факторов придает комплексу уникальные регуляторные свойства, обеспечивая изменение специфичности его взаимодействия с регуляторными последовательностями ДНК и регуляторными белками аппарата транскрипции.

Гипотеза

Уровень экспрессии мРНК для генов MAX и MAD можно выявлять методом ОТ/ПЦР, при этом существует оптимальное количество циклов.

Задачи

1. Провести анализ научной литературы по теме исследования.

2. Проанализировать значение продуктов генов MAX и MAD в регуляции транскрипции (анализ теоретических источников).

3. Провести ОТ/ПЦР для генов MAX и MAD с целью определения уровня экспрессии их мРНК в разных условиях (разное количество циклов).

4. Провести электрофорез продуктов ОТ/ПЦР.

5. Окрасить и сфотографировать гели после электрофореза.

6. Сделать выводы об оптимальных условиях проведения ОТ/ПЦР для генов MAX и MAD.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Амплификация — накопление копий определенной нуклеотидной последовательности во время ПЦР.

В работе были использованы очищенные ганидинизотиоционатным методом препараты тотальной клеточной РНК из линии клеток К562 (миелолейкоз человека). Работа с материалом проводилась под ламинаром. Оптимизация условий ПЦР проведения ОТ/ПЦР для генов MAX и MAD с целью определения уровня экспрессии их мРНК включала в себя выбор количества циклов реакций.

На первом этапе работы была проведена оптимизация условий анализа мРНК для генов MAX и MAD с целью определения уровня экспрессии их мРНК в разных условиях (разное количество циклов) генов методом ОТ-ПЦР. Затем провели электрофорез с приготовленными предварительно гелем. На заключительном этапе провели окрашивание агарозного геля. 

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Набор оборудования для проведения электрофореза ДНК в агарозном геле

• Набор материалов и реактивов для определения ДНК, включая образцы ДНК и «зеленые маркеры»

• Пипетка автоматическая

• Ламинарный шкаф

• Лабораторный блок для проведения ПЦР

Результаты

Гипотеза, сформулированная в начале исследования, полностью подтвердилась.

Объединение факторов транскрипции и других регуляторных белков в большие регуляторные комплексы при каждом новом сочетании факторов придает комплексу уникальные регуляторные свойства, обеспечивая изменение специфичности его взаимодействия с регуляторными последовательностями ДНК и регуляторными белками аппарата транскрипции.

Образование позитивно или негативно действующего фактора транскрипции во время экспрессии одного и того же гена регулируется в онтогенезе, в процессе дифференцировки тканей или в ответ на определенные внешние сигналы в конкретной группе клеток. Поэтому крайне важным представляется определение уровня экспрессии мРНК таких генов.

По результатам исследования можно сделать вывод, что и для гена МАD, и для гена МАХ при проведении ОТ/ПЦР оптимальным при выбранных условиях будет 35 циклов.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России.