Выбор и оптимизация условий ОТ/ПЦР для высокоэффективного анализа уровня экспрессии мРНК гена c-MYC

Актуальность

В последние годы происходит интенсивное накопление информации, необходимой для понимания молекулярных механизмов возникновения и развития раковых заболеваний. Полученные знания способствуют разработке новых классов противоопухолевых агентов, направленных на ингибирование пролиферации клеток. В настоящее время для лечения некоторых типов опухолей успешно используются препараты, направленные на специфическое блокирование функции ряда белков, ответственных за развитие опухолевого процесса. Разработка препаратов, направленных на ингибирование онкогенов семейства MYC, является важным направлением в противоопухолевой терапии. Для этого необходимо иметь высокоточные инструменты, позволяющие отследить уровень экспрессии генов этого семейства.

Гипотеза

Уровень экспрессии мРНК для гена c-MYC можно эффективно выявлять методом ОТ/ПЦР, при этом существует оптимальное количество циклов.

Цель

Выбор и оптимизация условий ОТ/ПЦР для высокоэффективного анализа уровня экспрессии мРНК гена c-MYC.

Задачи

1. Провести анализ теоретических источников, описывающих роль продукта гена c-MYC в регуляции транскрипции (обзор литературы).

2. Провести ОТ/ПЦР для гена c-MYC в целях определения уровня экспрессии его мРНК в разных условиях (разное количество циклов).

3. Сделать выводы об оптимальных условиях проведения ОТ/ПЦР для гена c-MYC в целях определения уровня экспрессии их мРНК.

Описание работы

Очищенные гуанидинизотиоционатным методом препараты тотальной клеточной РНК были предоставлены лабораторией профессора А.И. Глухова.

Работа с РНК (добавление РНК в смесь ОТ/ПЦР) проводилась под ламинаром, в перчатках и в маске. Оптимизация условий ПЦР проведения ОТ/ПЦР для гена с-MYC в целях определения уровня экспрессии его мРНК включала в себя выбор количества циклов реакций.

Электрофорез специфических продуктов ОТ-ПЦР в 2% агарозном геле. В качестве РНК-матрицы на стадии ОТ использовали 1 мкг тотальной клеточной РНК, полученной из клеточной линии Bro (меланома человека).

Гели снимали на цифровую фотокамеру Kodak и проводили анализ изображения на компьютере с помощью программ ImageJ 1.35I и Quanty One v.4.4.0. Уровни экспрессии исследуемых генов нормализовали по отношению к уровню экспрессии конститутивного гена (β-актина), который принимали за единицу.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Лабораторный блок для проведения ПЦР или ОТ/ПЦР в реальном времени
• Камера для проведения горизонтального электрофореза
• Система документации результатов электрофореза Kodak
• Программное обеспечение ImageJ 1.35I и Quanty One v.4.4.0

Результаты

В ходе исследования были получены следующие результаты.

1. Оптимизация условий ПЦР проведения ОТ/ПЦР для гена с-MYC в целях определения уровня экспрессии его мРНК включала в себя выбор количества циклов реакций.

2. Анализ изображений на компьютере позволил нормализовать уровень экспрессии гена с-МYC по отношению к уровню экспрессии конститутивного гена β-актина.

3. Анализ экспрессии мРНК гена с-МYC можно проводить с помощью метода ОТ/ПЦР с высокой эффективностью, при этом можно использовать 1 мкг тотальной клеточной РНК. Более того, было видно, что на геле, кроме специфического продукта ОТ/ПЦР, указывающего на присутствие мРНК с-МYC в образце, отсутствуют неспецифические фрагменты ДНК, что говорит о высокой специфичности анализа.

4. Можно сделать вывод, что для гена с-МYC при проведении ОТ/ПЦР оптимальным при выбранных условиях будет 35 циклов.

Таким образом, гипотеза, сформулированная в начале исследования, полностью подтвердилась: уровень экспрессии мРНК для гена c-MYC можно эффективно выявлять методом ОТ/ПЦР, при этом существует оптимальное количество циклов.

Награды/достижения

Победитель открытой городской научно-практической конференции «Наука для жизни» в секции «Биотехнологии. Молекулярная биология. Генетика» среди работ учащихся 7−9 классов.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России

Перспективы развития результатов работы

Применение результатов проведенной оптимизации в анализе уровня гена c-MYC.