Оптимизация метода ОТ/ПЦР для анализа генов MAX и MAD

Актуальность

Эукариотические факторы транскрипции реализуют механизм регуляции экспрессии генов комбинаторного типа. Молекулы факторов транскрипции обладают консервативными доменами, которые дают им возможность осуществлять высокоспецифические белок-белковые и белково-нуклеиновые взаимодействия. In vivo происходит объединение факторов транскрипции и других регуляторных белков в большие регуляторные комплексы. Каждое новое сочетание факторов придаёт комплексу уникальные регуляторные свойства, обеспечивая изменение специфичности его взаимодействия с регуляторными последовательностями ДНК и регуляторными белками аппарата транскрипции.

Образование позитивно или негативно действующего фактора транскрипции во время экспрессии одного и того же гена регулируется в онтогенезе, в процессе дифференцировки тканей или в ответ на определённые внешние сигналы в конкретной группе клеток.

Именно поэтому крайне важным представляется определение уровня экспрессии мРНК таких генов.

Цель

Выявить оптимальные условия анализа экспрессии генов МАХ и MAD с целью определения уровня экспрессии их мРНК.

Задачи

1. Проанализировать значение белковых продуктов генов МАХ и MAD в регуляции транскрипции.

2. Провести ОТ/ПЦР с целью определения уровня экспрессии мРНК МАХ и MAD при различных количествах циклов ПЦР.

3. Провести электрофорез продуктов ОТ/ПЦР.

4. Окрасить, сфотографировать и провести анализ изображений геля после электрофореза.

5. Сделать выводы об оптимальных условиях проведения ОТ/ПЦР относительно числа циклов ПЦР в отношении генов МАХ и MAD с целью определения уровня экспрессии их мРНК.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Амплификатор для проведения ПЦР в режиме реального времени

• Прибор для электрофореза

• Фотокамера Kodak

• Программное обеспечение GeneTools 4.3.8.

Описание

Очищенные гуанидинизотиоционатным методом препараты тотальной клеточной РНК из линии клеток К562 (миелолейкоз человека) были предоставлены кафедрой биологической химии Сеченовского Университета. Работа с РНК (добавление РНК в смесь ОТ/ПЦР) проводилась под ламинаром в перчатках и в маске.

Исследование состояло из нескольких этапов.

1. Проведена оптимизация условий анализа мРНК для генов МАХ и MAD с целью определения уровня экспрессии их мРНК в разных количествах циклов генов методом ОТ/ПЦР. Результаты анализа изображений на компьютере проводили с помощью программ GeneTools v.4.3.8. При этом уровни экспрессии исследуемых генов нормализовали по отношению к уровню экспрессии конститутивного гена (β-актина).

2. Проведён электрофорез продуктов ПЦР, полученных на первом этапе работы.

3. Продукты были окрашены бромистым этидием и сфотографированы результаты электрофореза. Гели сняты на цифровую камеру системы гельдокументирования Syngene G:BOX, проведён анализ изображения на компьютере с помощью программного обеспечения GeneTools 4.3.8.

Результаты

В процессе работы было установлено, что при прочих равных условиях наибольшее количество специфического ПЦР-продукта нарабатывается при 35 циклах ПЦР-амплификации.

Фотография разделения продуктов ОТ/ПЦР методом гель-электрофореза.
Цифрами обозначено количество проведённых циклов ОТ/ПЦР.

График зависимости интенсивности свечения специфических ПЦР-продуктов генов MAX и MAD от количества проведённых циклов ПЦР

Выводы

1. Для генов МАХ и MAD при выбранных условиях проведения ОТ/ПЦР оптимальным будет 35 циклов ПЦР.

2. Относительные уровни экспрессии мРНК генов МАХ и MAD можно эффективно анализировать методом ОТ/ПЦР при одинаковом температурном режиме и одинаковом количестве циклов ПЦР, что, в свою очередь, даёт возможность оценить соотношение активностей генов МАХ и MAD и прогнозировать пути регуляции (репрессии или активации) транскрипционной активности важного фактора cMyc.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), кафедра биологической химии