Исследование взаимного действия ингибиторов на каскад коагуляции

Актуальность

В больницах при переливании крови, операциях и для хранения крови необходимо предотвратить процесс свёртывания крови. Для этих целей сейчас используется препарат «Цибор» - низкомолекулярное вещество, которое вне организма предотвращает процесс коагуляции. Однако он имеет ряд недостатков. Поэтому постоянно ведутся поиски ингибиторов, которые бы подавляли каскад коагуляции в небольших концентрациях и без cерьёзных побочных действий. Наиболее актуальны ДНК- и РНК-аптамеры. Они могут стать лучшими лекарствами по сравнению с существующими аналогами, так как имеют ряд преимуществ:

- их легко получить химическим синтезом в нужных для терапевтического применения количествах;

- они практически не имеют иммуногенности, то есть не вызывают иммунного ответа в организме;

- можно регулировать уровень их содержания и в случае необходимости подобрать антидот (комплементарный олигонуклеотид), что почти исключает опасность передозировки;

- их высокая растворимость обеспечивает возможность осуществления внутримышечных и подкожных инъекций.

Цель

Сравнить индивидуальные действия ДНК-аптамера RA-36, РНК-аптамера RB006 и препарата «Цибор», а также их попарное действие в разных комбинациях на установление возможности синергизма.

Задачи

1. Изучить литературу по теме исследования.

2. Ознакомиться с принципом работы спектрофотометра.

3. Построить кривые генерации тромбина, определить три характеристических параметра (пиковое время, время задержки, эндогенный потенциал) для каждого ингибитора в отдельности и попарно.

4. Выявить наличие синергизма между аптамерами и препаратом «Цибор».

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Спектрофотометр TECAN

• 96-луночный микропланшет

• Пипетатор

• Химические реактивы

• Реагенты in vitro для исследования гемостаза («Сименс Хелскеа Диагностикс Продактс ГмбХ», Германия)

• «Цибор 2500» («Берлин-Фарма», Россия)

•Аптамер ДНК RA-36

•Аптамер РНК RB006

Описание

В работе исследовалась возможность ингибирования каскада коагуляции с помощью аптамеров ДНК и РНК и взаимного действия аптамеров и препарата «Цибор». Был выбран метод проведения эксперимента – тест генерации тромбина (ТГТ), т. к. он позволяет следить за динамикой концентрации тромбина на всём протяжении работы каскада коагуляции. В каждую лунку микропланшета внесли 40 мкл плазмы (имитатор), 25 мкл флуорогенного субстрата, 25 мкл дистиллированной воды и 10 мкл активатора, затем загрузили в спектрофотометр. Данные с прибора поступали на компьютер в соответствующую программу, которая выдала первичные кривые генерации тромбина. Эти кривые, показывавшие зависимость флуоресценции от времени, прибор преобразовал в кривые генерации тромбина путём дифференцирования.

Кривые генерации характеризовались тремя параметрами:

- лаговое время или время задержки каскада – время, когда тромбин не образуется;

- пиковое время – время максимальной концентрации тромбина;

- эндогенный потенциал (площадь под кривой генерации) – количество образовавшегося тромбина.

Для сравнения ингибиторов вместо 25 мкл дистиллированной воды автор добавлял растворённые в воде аптамеры или препарат «Цибор» по отдельности, а потом попарно в различных комбинациях. Получились кривые генерации тромбина, отличавшиеся от первоначальных и характеризовавшие их по трём параметрам.

Результаты

Полученные результаты представлены в виде графиков, в которых для каждого ингибитора приведены лаговое время, пиковое время и эндогенный потенциал.

1. Генерация тромбина замедляется в присутствии всех ингибиторов.

2. Динамика увеличения пикового времени коррелирует с динамикой времени появления тромбина для всех ингибиторов.

3. По мере увеличения количества любого из ингибиторов эндогенный потенциал уменьшается, а, стало быть, снижается и суммарное количество сгенерированного в каскаде тромбина.

4. Анализ графиков позволил выбрать оптимальную концентрацию для попарного сравнения ингибиторов. Суммарное действие является средним арифметическим значений показателей. В случае сочетания RB006 с «Цибором» их ингибирующая активность являлась суммой эффектов каждого ингибитора в отдельности. Сочетание RA-36 и RB006 дало эффект чуть лучше, чем суммарный эффект двух ингибиторов. Сочетание «Цибора» с RA-36 оказывает в несколько раз большее ингибирующее действие, чем ожидалось, исходя из предположения аддитивности действия ингибиторов, т. е. в данном случае наблюдается синергизм.
На графиках показаны: а) характеристические параметры теста генерации тромбина, б) первичные кривые флуоресценции.

Вывод

При попарном введении ингибиторов возможен синергизм действия. Синергизм ярко наблюдался только в одной паре – RA-36 и препарат «Цибор».

Перспективы использования результатов работы
Наличие синергизма между аптамером и препаратом «Цибор» даёт перспективу создания новых классов лекарственных средств, в которых концентрация низкомолекулярных гепаринов будет гораздо ниже.

Сотрудничество с вузом при создании работы

МГУ имени М. В. Ломоносова

Мнение автора

«Я рада, что последние два года училась в школе, которая участвует в проекте «Медицинский класс в московской школе». Здесь я смогла не только получить новые знания, но и познакомиться с людьми, которые также хотели бы связать своё будущее с медициной. Я выбрала секцию «Биохимия», потому что, по моему мнению, именно за этой наукой будущее медицины. Я хочу, чтобы данный проект развивался дальше, организовывалось больше различных мероприятий, которые бы позволяли учащимся знакомиться с будущей профессией»