Поиск новых генов и регуляторных механизмов, отвечающих за формирование и поддержание статуса предшественников половых клеток Drosophila melanogaster

Актуальность

У животных описаны два основных механизма формирования половых клеток: предетерминированный механизм, при котором предшественники половых клеток формируются из строго определённой группы клеток, которая обосабливается на ранних этапах эмбриогенеза. Второй механизм – индукционный, при котором половые клетки формируются на более поздних стадиях развития под действием стимулирующих сигналов из клеток, не отличающихся от соматических. Drosophila melanogaster относится к организмам с первым типом формирования половых клеток. Дрозофила является удобным модельным объектом для изучения репрессии транскрипции, поскольку её эмбриональное развитие глубоко изучено. При развитии предшественников половых клеток мух дрозофил не происходит транскрипция, что позволяет клеткам оставаться в недиффренцированном состоянии до начала гаметогенеза. Механизм, обеспечивающий этот процесс, до сих пор до конца не изучен.

Цель

Выявить новые, ещё не описанные механизмы, обеспечивающие правильное развитие половых клеток.

Задачи

1. Установить, как меняется структура хроматина в ППК (предшественники половых клеток) на стадиях первичного формирования.

2. Провести окраску двухчасовых эмбрионов дрозофилы антителами к основным факторам транскрипции.

3. Выявить различия в их эмбриональной локализации в ППК и соматических клетках.

4. Используя линию мух с мутацией, приводящей к стерильности, установить, как меняется экспрессия факторов репрессии транскрипции.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Лабораторная посуда (воронки, чашки с питательной средой, пипетки, пробирки, предметные и покровные стёкла)

• Флуоресцентный конфокальный микроскоп Leica SP2

• Химические реактивы

• Первичные антитела к основным факторам транскрипции и гетерохроматина (РНК-полимераза 2ser2, РНК-полимераза 2ser5, TAF1, TBP, HP1)

• Вторичные антитела Alexa 488, Alexa 555

• Центрифуга

• Ротатор

Описание

На первом этапе работы был проведён анализ литературных источников о процессе формирования транскрипционного молчания в ППК дрозофилы.
На следующем этапе автором были собраны эмбрионы мух дрозофил.

Для этого предварительно содержали мух на чашке с кормом в течение 10 часов. Затем проводилась замена чашки каждые два часа три раза для получения наибольшей синхронизации откладки яиц мухами и максимального количества эмбрионов в необходимой стадии. После последней смены и последующего содержания на чашке с кормом в течение двух часов автор смывал эмбрионы с чашки водой. Сначала фиксировал в 4%-м растворе параформальдегида, затем промывал трижды раствором фосфатного буфера – PBS. Далее проводилась последующая фиксация и дегидратация этанолом. Для предотвращения неспецифического связывания автор инкубировал образцы в 4%-м растворе сухого молока в течение суток и добавил первичные антитела. После инкубации в течение суток образцы отмыли от избытка несвязанных антител раствором фосфатного буфера и добавили в них вторичные антитела. Готовые эмбрионы перенесли на предметное стекло, добавили заключающую среду с DAPI, покрыли препарат покровным стеклом и закрепили с помощью лака для ногтей.

Работа на флуоресцентном микроскопе проводилась под руководством научного сотрудника Института биологии гена РАН.

Результаты

1. В результате работы были определены два белка, оказывающие непосредственное влияние на репрессию транскрипции. При использовании протокола окраски двухчасовых эмбрионов дрозофилы с помощью первичных и вторичных флуоресцентно меченых антител установлено, что на ранних этапах формирования ППК существенный вклад в транскрипционное молчание вносит белок TBP (связывающий белок, участвует в формировании преинициаторного комплекса на промоторе гена).

2. Главный белок гетерохроматина HP1 формирует репрессию транскрипции путём конденсации хроматина в области ядерной мембраны. Данный процесс не зависит от наличия детерминанты полярной плазмы nanos.

Локализация HP1 в ППК и соматических клетках

Локализация TBP

А – окраска по DAPI (локализация ядер)

 Б – локализация TBP

 В – наложение изображений А и Б

Г – окраска TBP в линии nos-

Выводы

1. Некоторые из основных факторов транскрипции, участие которых в формировании статуса половых клеток ранее не изучалось, могут вносить существенный вклад в формирование транскрипционного молчания.

2. Один из важнейших факторов инициации транскрипции – TBP –  практически отсутствует в полярных клетках. При этом мутация nos- приводит к активации экспрессии данного белка в ППК. Предположительно, именно TBP – ключевой фактор, обеспечивающий транскрипционное молчание в ППК на ранних этапах формирования полярных клеток.

Перспективы использования результатов работы

Полученные результаты позволяют углубиться в понимание механизмов экспрессии генов, а также могут быть использованы для биомедицинского направления в сфере репродуктивной функции человека.

Сотрудничество с учреждением при создании работы

ИБГ РАН

Мнение автора                                 

«Благодаря проекту «Медицинский класс в московской школе» и конференции «Старт в медицину» я смог получить бесценный опыт работы с научным материалом. Это уникальная возможность соприкоснуться с миром исследований и получить новые знания в выбранной сфере»