Поиск подходов к повышению эффективности амплификации ДНК фага лямбда методом ПЦР

Актуальность

Амплификация протяжённых фрагментов ДНК необходима при исследовании структуры генов высокомолекулярных белков и их регуляторных последовательностей, полицистронных генов в оперонах бактерий. Крайне важным является выявление оптимальных условий протекания этой ДНК-полимеразной реакции.

Цель

Провести сравнительный анализ повышения эффективности амплификации протяжённых фрагментов ДНК на примере ДНК фага λ (лямбда) методом ПЦР в зависимости от концентрации праймеров, рН и ионной силы реакционного буфера и наличия термостабильной пирофосфатазы.

Задачи

1. Отработать условия амплификации протяжённых участков ДНК фага λ методом ПЦР.

2. Выявить условия успешного протекания лонг-дистанс ПЦР в зависимости от типа праймеров, рН и ионной силы реакционного буфера и наличия термостабильной пирофосфатазы.

3. Выявить влияние термостабильной пирофосфатазы на лонг-дистанс ПЦР.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Лабораторный блок для проведения ПЦР

• Камера для проведения электрофореза

• Цифровая фотокамера в системе гель-документирования Syngene G:BOX

• Программное обеспечение для анализа изображений на компьютере GeneTools 4.3.8.

Описание

Работа состояла из нескольких этапов.

1. Исследование по влиянию концентрации праймеров на выход специфического ПЦР-продукта. Реакционная смесь содержала различные концентрации каждого из праймеров (20 циклов ПЦР).

2. Исследование влияния рН реакционной среды и ионной силы на выход специфического ПЦР-продукта.

3. После проведения оптимизации концентрации пар праймеров, ионной силы реакционной смеси и рН реакционного раствора провели ПЦР-амплификацию фрагментов ДНК фага лямбда различной длины.

4. Исследование влияния продукта ДНК-полимеразной реакции – пирофосфата на эффективность ПЦР.

5. Исследование влияния термостабильной пирофосфатазы на эффективность ПЦР. ПЦР (25 циклов) проводили с праймерами, дающими продукт размером 5700 п. н.

Результаты

1. Наибольший выход ПЦР-продукта наблюдался при концентрации праймеров в реакционной среде 0,3 мкМ.

1 – 1,0 мкМ; 2 – 0,65 мкМ; 3 – 0,3 мкМ; 4 – 0,2 мкМ; 5 – 0,08 мкМ

2. Значение ионной силы равнялось 0,08. Значение рН в реакционной среде равнялось 8,8.

Влияние ионной силы (А) и рН (Б) на эффективность выхода продукта ПЦР. А – значение ионной силы в реакционной смеси. 1 – 0,04; 2 – 0,06; 3 – 0,08; 4 – 0,1; 5 – 0,15; 6 – 0,2. Б – значение рН в реакционной среде. 1 – 7,0; 2 – 7,5; 3 – 8,0; 4 – 8,5; 5 – 8,8; 6 – 9,0.

3. После проведения оптимизации условий ПЦР-амплификации автору удалось проамплифицировать ПЦР-фрагмент протяжённостью 8457 п. н.

Эффективность различной ПЦР-амплификации фрагментов ДНК различной длины.

Размер ПЦР-продуктов: 1 – 500 п. н.; 2 – 1271 п. н.; 3 – 3269 п. н.; 4 – 5695 п. н.; 5 – 8457 п. н.; М – маркеры молекулярной массы ДНК (EcoR1/HindIII).

4. Пирофосфат в концентрации 0,25 мМ значительно снижает выход ПЦР-продукта.

Влияние пирофосфата на эффективность ПЦР. Реакционная смесь с различными концентрациями пирофосфата (мМ): 1 – 0,0 (контроль); 2 – 0,03; 3 – 0,06; 4 – 0,125; 5 – 0,25; 6 – 0.5; 7 – 1.0; 8 – 1.5.

5. Пирофосфат как продукт ДНК-полимеразной реакции расщеплялся ферментом, что приводило к снижению ингибирования термостабильной ДНК-полимеразы и повышению выхода ПЦР-продукта. Реакционная смесь содержала 0,25 ед. термостабильной пирофосфатазы.

Реакционная смесь с различными концентрациями пирофосфата. 1 – 0,0 мМ (контроль); 2 – 0,03 мМ; 3 – 0,06 мМ; 4 – 0,125 мМ; 5 – 0,25 мМ; 6 – 0,5 мМ; 7 – 1,0 мМ; 8 – 1,5 мМ.

Выводы

1. Амплификация фрагментов различной длины ДНК фага λ методом ПЦР после осуществления подбора оптимальных концентраций праймеров, значений рН и ионной силы реакционной смеси показала эффективность проведённой оптимизации для успешного проведения лонг-дистанс ПЦР.

2. Исследования по добавлению термостабильной пирофосфатазы в ПЦР-реакцию показали, что пирофосфат как продукт ДНК-полимеразной реакции расщепляется ферментом, что приводит к снижению ингибирования термостабильной ДНК-полимеразы и повышению выхода ПЦР-продукта.

Перспективы использования результатов работы

Результаты данной работы могут помочь облегчить проведение полимеразной цепной реакции, а также исследование анализов ПЦР-тестов и исследований, особенно во время пандемии, когда они стали более актуальны.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)

Награды/достижения

Открытая городская научно-практическая конференция «Курчатовский проект – от знаний к практике, от практики к результату», 2020 г. – призёр.

Мнение автора

«Работать над проектом было полезно и увлекательно. Проект «Медицинский класс в московской школе» невероятно интересный, участвовать в нём почётно и здорово. Надеюсь, что данный проект распространится по всей России, потому что он позволяет ученикам понять и познать то возможное будущее, которое они себе выбрали. Участвовать на конкурсе «Старт в медицину» было волнительно и здорово. Я получила много новых знаний, приобрела опыт презентации проектных работ»