Исследование цитоплазматической ДНК растений рода Cenchrus для создания хлоропластных маркеров на основе вариабельных STR-локусов

Актуальность

Ценхрус длинноколючковый (C. longispinus) – однолетняя трава, сорное карантинное растение. Оно обладает статусом одного из самых экономически губительных сорняков в мире: угнетает рост важнейших сельскохозяйственных злаковых культур, значительно снижая урожай; повреждает желудочно-кишечный тракт крупного и мелкого рогатого скота при выпасе; засоряет шерсть животных острыми соплодиями. Растения в местах произрастания могут повреждать кожу человека, оставляя длительно незаживающие раны; способны изменять естественные биотопы, вытесняя эндемичные виды. Площадь очагов распространения карантинного вида на территории стран, граничащих с РФ, увеличивается за последние годы.

Растения рода Ценхрус (Cenchrus) схожи с другими злаками на ранней стадии своего развития, что создаёт проблему идентификации карантинного вида в инвазивных очагах. Возможное наличие C. longispinus во ввозимой подкарантинной продукции растительного происхождения вызывает необходимость в его идентификации и достоверной дифференцировке растения от других морфологически близких видов, что является актуальной задачей гербологической экспертизы и фитосанитарного контроля импортного подкарантинного растительного материала.

Цель

Поиск видоспецифичных хлоропластных маркеров рода Cenchrus.

Задачи

1. Выделение ДНК коллекционных образцов.

2. Выявление вариабельных регионов в геномах видов рода Cenchrus.

3. Моделирование праймеров на выбранные регионы.

4. Апробация смоделированных праймеров.

5. Анализ полученных результатов.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Набор реагентов для выделения нуклеиновых кислот из растительного материала «ФитоСорб»

• Ротационный гомогенизатор Precellys Evolution

• Амплификатор детектирующий CFX-96

• Трансиллюминатор TCP-20.LC

• Генетический анализатор для капиллярного электрофореза НАНОФОР-05

• ПО ДНК ФА

• ПО UGENE

Описание

Автор обработал образцы семи видов растений рода Ценхрус, предоставленных Всероссийским центром карантина растений. Листья растений были подвергнуты сначала физической, а затем химической обработке по выделению хлоропластной ДНК. На основе секвенированного (имеющего вид …ATTTCGAAT…) хлоропластного генома автор выделил 12 локусов-претендентов для возможного дифференцирования видов растений рода Cenchrus, после чего было разработано 12 пар праймеров с флуоресцентной меткой к этим локусам. Этими праймерами каждый вид подвергли полимеразной цепной реакции, что позволило получить большую концентрацию необходимых фрагментов-локусов для дальнейшего использования метода капиллярного электрофореза с флуоресцентной детекцией.

Биоинформатический анализ и обработку данных фрагментного анализа проводили с помощью программного обеспечения ДНК ФА.

Классическую ПЦР проводили на приборе MiniAmp Plus с использованием 2,5х реакционной смеси с концентрациями MgCl₂ – 3 mM и dNTP – 0,25 mM, и SynTaq ДНК-полимеразы с ингибирующими активность фермента антителами, используя 2,5 единицы активности для ПЦР в финальном объёме реакции 25 мкл.

Результаты

1. Была выделена ДНК исследуемых образцов.

2. Выявлено 6 вариабельных регионов в геномах видов рода Cenchrus.

3. Были амплифицированы необходимые участки геномов образцов методом ПЦР.

4. При анализе участков не все регионы подтвердили ожидаемые результаты – несовпадение размеров InDel с полученными результатами. Требуется секвенирование.

5. Возможность проведения мультилокусного анализа для дифференциации карантинного вида с использованием пар № 1, 2, 4, 6, 8 и 9.

6. После проведения электрофореза и биоинформатического анализа полученных данных 6 локусов оказались информативными, а 6 – достаточно консервативными.

Полученные размеры исследуемых локусов

Выводы

1. Для точной идентификации биологического объекта необходимо использовать современные методы молекулярно-генетического анализа, такие как методы ПЦР, секвенирование.

2. Автором выявлена возможность проведения мультилокусного анализа для дифференциации карантинного вида с использованием 6 пар разработанных праймеров, а 6 полученных информативных локусов можно использовать в мультиплексной ПЦР для идентификации и дифференцирования видов растений рода Ценхрус и достаточно достоверно детектировать карантинный вид C. longispinus.

3. Новизна метода заключается в использовании приёма мультиплексирования, множественной реакции, основанной на одновременной амплификации большого количества локусов в одной пробирке, как установление генетического родства.

Перспективы использования результатов работы

Результаты исследования можно использовать для гербологической экспертизы растительного сырья при идентификации карантинного вида Cenchrus longispinus.

Сотрудничество с учреждением при создании работы

ФГБНУ ВНИИСБ