Исследование условий анализа экспрессии мРНК гена c-Myc

Актуальность

В последние годы происходит интенсивное накопление информации, необходимой для понимания молекулярных механизмов возникновения и развития раковых заболеваний. Разработка препаратов, направленных на ингибирование онкогенов семейства Myc, является важным направлением в противоопухолевой терапии. Для этого необходимо иметь высокоточные инструменты, позволяющие отследить уровень экспрессии генов этого семейства. 

Цель

Выбрать и оптимизировать условия ОТ/ПЦР для высокоэффективного анализа уровня экспрессии мРНК гена c-Myc.

Задачи

1. Провести анализ теоретических источников, описывающих роль продукта гена c-Myc в регуляции транскрипции.

2. Провести ОТ/ПЦР для гена c-Myc с целью определения уровня экспрессии его мРНК в разных условиях.

3. Провести электрофорез продуктов ОТ/ПЦР, окрасить, сфотографировать и выполнить анализ изображений геля после электрофореза.

4. Сделать выводы об оптимальных условиях проведения ОТ/ПЦР для гена c-Myc с целью определения уровня экспрессии их мРНК.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Амплификатор для проведения ПЦР в режиме реального времени

• Прибор для электрофореза

• Фотокамера Kodak

• Программа GeneTools 4.3.8.

Описание

Автор провёл анализ теоретических источников, описывающих роль продукта гена c-Myc в регуляции транскрипции; узнал расположение гена в хромосоме и его структуру.

Исследование состояло из нескольких этапов.

1. В специальном лабораторном блоке провели ОТ/ПЦР для гена c-Myc с целью определения уровня экспрессии его мРНК в разных условиях. Реакция образования первой цепи: комплементарная ДНК (cDNA) образуется на матрице мРНК из dNTP обратной транскриптазой. Компоненты реакции смешивали с ДНК-праймером, комплементарным исследуемой мРНК, и буфером с обратной транскриптазой на один час при 37 °C. Реакция образования второй цепи: после того как обратная транскрипция была закончена и образована cDNA на матрице мРНК, следующие циклы проводили по стандартной методике ПЦР. После проведения 25–35 циклов ПЦР образуются миллионы копий нужной последовательности.

2. Приготовили агарозный гель, осуществили электрофорез и окрашивание.

3. Провели анализ и документирование цифрового изображения. Гели снимали на цифровую фотокамеру системы гельдокументирования Syngene G:BOX и проводили анализ изображения на компьютере с помощью программного обеспечения GeneTools 4.3.8. Уровни экспрессии исследуемых генов нормализовали по отношению к уровню экспрессии конститутивного гена (β-актина), который принимали за единицу.

4. Провели анализ образцов cDNA гена c-Myc от пациентов с раком щитовидной железы и рассчитали относительный уровень экспрессии мРНК c-Myc у этих пациентов. Работа с РНК (добавление РНК в смесь ОТ/ПЦР) проводилась под ламинаром, в перчатках и в маске.

Результаты анализа экспрессии гена c-Myc в клинических образцах, полученных от пациентов с РЩЖ, показали, что доля пациентов со средней экспрессией гена c-Myc составила 28,8%, а с высокой экспрессией – 71,2%.

Результаты

1. Оптимизация условий проведения ОТ/ПЦР для гена c-Myc с целью определения уровня экспрессии его мРНК включала в себя выбор количества циклов реакций.

Фотография интенсивности свечения окрашенного продукта реакции для гена c-Myc в зависимости от количества циклов реакции ОТ/ПЦР

2. Анализ изображений на компьютере с помощью программы GeneTools v.4.3.8. позволил нормализовать уровень экспрессии гена c-Myc по отношению к уровню экспрессии конструктивного гена β-актина.

Для гена c-Myc при проведении ОТ/ПЦР оптимальными при выбранных условиях оказались 35 циклов.

3. Анализ методом ОТ/ПЦР экспрессии генов c-Myc и β-актина в клинических образцах, полученных от пациентов с раком щитовидной железы (РЩЖ), позволил определить экспрессию данных генов. Электрофорез в 1,8% агарозном геле, содержащем 5 мкг/мл бромистого этидия. Доля пациентов со средней экспрессией гена c-Myc составила 28,8% (2 пациента) и с высокой экспрессией – 71,2% (5 пациентов).
1–7 – номера клинических образцов. К+ – положительный контрольный образец, клеточная линия BrO. К- – отрицательный контрольный образец (ОТ-реакцию проводили в отсутствии мРНК).                                                          

Выводы

1. Анализ экспрессии мРНК гена c-Myc можно проводить с помощью метода ОТ/ПЦР с высокой эффективностью, при этом возможно использовать 1 мкг тотальной клеточной РНК. Более того, кроме специфического продукта ОТ/ПЦР, указывающего на присутствие мРНК c-Myc в образце, отсутствуют неспецифические фрагменты ДНК, что говорит о высокой специфичности анализа.

2. Для гена c-Myc при проведении ОТ/ПЦР оптимальными при выбранных условиях будут 35 циклов.

Перспективы использования результатов работы

Высокоточные инструменты, позволяющие отследить уровень экспрессии генов семейства c-Myc, можно использовать при разработке препаратов, направленных на ингибирование онкогенов этого семейства.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), кафедра биологической химии

Мнение автора

«Конференция «Старт в медицину» дала мне возможность поработать с такой интересной темой. Полученные результаты стоили большого количества времени, которое я потратила, работая над проектом»