Экспресс-способ оценки антибиотикорезистентности бактерий

Актуальность

Эволюционно все живые организмы адаптируются к окружающей среде и внешним раздражителям. Современное человечество всё чаще сталкивается с тем, что бактерии, вызывающие различные заболевания, поколение за поколением вырабатывают терпимость к различным видам антибиотиков. Остро стоит вопрос изучения новых антибиотиков и их влияния на бактерии. Кроме того, в клинической практике необходимо как можно быстрее определить, к каким антибиотикам чувствительны бактерии, вызвавшие заболевание. Однако существующие процедуры бактериального посева дают результат только через 4–7 дней, в зависимости от типа отобранного материала.

С другой стороны, геометрические размеры бактерий при заданных внешних условиях являются характеристиками морфотипа, а при изменении внешних условий и воздействии различных факторов (например, антибиотиков) величина и динамика изменения геометрии мембран бактерий являются интегральными параметрами этого воздействия. Определить с высокой точностью размеры бактерий и состояние их стенок способна техника зондовой сканирующей микроскопии, которая в последние 5–10 лет стала гораздо доступнее широкому кругу пользователей.

Цель

Практически разработать метод экспресс-определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

Задачи

1. Проанализировать источники литературы, касающиеся использования сканирующего зондового микроскопа (СЗМ) для исследования бактерий.

2. Ознакомиться с теоретическими основами зондовой микроскопии и приобрести навыки работы на сканирующем зондовом микроскопе NanoEducator II (Наноэдьюкатор II).

3. Провести экспериментальную апробацию предложенных методов размещения бактерий и оценки их антибиотикорезистентности. Решая данную задачу, мы сможем установить преимущества предлагаемого способа диагностики влияния антибиотиков на бактерии.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Сканирующий зондовый микроскоп NanoEducator II

• Покровные стёкла

• Чашки Петри

Описание

При мониторинге резистентности бактерий возникают такие трудности, как перекрывание бактерий друг другом при их большой плотности в среде. Существующие методы поштучного манипулирования микро- и нанообъектами в небольшом количестве, такие как оптический пинцет и зондовая нанолитография, в принципе позволяют располагать бактерии на подложке заданным образом. Но когда для статистической достоверности необходимы манипуляции с сотнями и тысячами бактерий, использование известных методов превращается в долгую и поэтому дорогостоящую работу. В данном случае необходимо такое решение, в котором бактерии сами, т. е. без воздействия оператора, автоматически располагались бы на подложке параллельно друг другу.

Ещё до экспериментов по расположению бактерий параллельно именно с помощью подложки автор изучил возможные способы манипулирования ими. Высокой степени параллельности бактерий можно добиться, располагая их с помощью физических (таких как электрический ток) и химических (магнитные жидкости) методов. Но при работе с живыми бактериями такие методы крайне резко влияют на достоверность результатов, так как изменяют химическое и структурное устройство изучаемых объектов.

Автор, исходя из использования пространственно-периодических Ван дер Ваальсовых сил, предложил и апробировал решение использовать подложки, поверхность которых имеет на наноуровне периодический рельеф, например синусоидальный. При осаждении бактерий из раствора они в первую очередь будут касаться выступов рельефа, а затем будут притянуты к подложке по направлению вдоль этих выступов, поскольку в этом направлении действие молекулярных сил притяжения между поверхностями бактерии и подложки максимально.

В процессе такого направленного осаждения бактерий из жидкости на подложку важно уменьшить подвижность бактерий с тем, чтобы сила её собственного смещения стала меньше Ван дер Ваальсовых сил. Это можно осуществить двумя непротиворечащими друг другу путями. Первый путь ‒ охлаждение подложки и жидкости с бактериями до 0 °С, что снижает собственную подвижность бактерий. Второй путь ‒ осаждать бактерии при комнатной температуре, но внести в раствор водорастворимую компоненту, не оказывающую негативного воздействия на бактерию (сахар или другая питательная субстанция), но существенно повышающую вязкость раствора. В этом случае движение и изгиб бактерий будет значительно подавлен силами вязкого трения в растворе.

В экспериментах подложками для осаждения бактерий служили покровные стекла 18х18х0,018 мм, у которых с помощью СЗМ Наноэдьюкатор II, работающего в полуконтактном режиме, был обнаружен синусоидальный рельеф с пространственным периодом 4 нм и высотой 3–4 нм.

Исследование проведено на примере бифидобактерий с использованием трёх типов антибиотиков с разным механизмом бактерицидного воздействия. 

Результаты

1. В ходе выполнения работы был разработан экспресс-способ оценки антибиотикорезистентности бактерий на основе метода их параллельного расположения.

2. На всех образцах было получено параллельно расположение бактерий в поле зрения, соответствующее предварительно установленному параллельному расположению периодичности их рельефа. При этом случаи перекрывания бактерий друг другом носили единичный характер и могли быть практически полностью устранены уменьшением времени осаждения бактерий.

3. На образцах подложек с добавленными на них антибиотиками видно, что величина и динамика изменения геометрии мембран бактерий поменялась.

4. При воздействии антибиотика Грамицидина С, нарушающего целостность клеточной стенки, мембрана бактерий лопнула, а соотношение частей стало в разы меньше контрольной группы. После взаимодействия бактерий с антибиотиком Цефотаксимом, нарушающего синтез клеточной стенки, бактерия увеличилась в объёме, и на полученном аспект-отношении видно увеличение её средних значений. Так как площадь и объём увеличились, то новой площади недостаточно для поддержания нормальной функциональной активности бактерии, и в результате она погибает. Гентамицин, блокирующий синтез белка, оказал большие воздействие на бактерию по сравнению с Цефотаксимом.

5. Получены два свидетельства о государственной регистрации программ для ЭВМ: № 2017661512 «Определение длин бактерий по их изображениям в зондовый сканирующий микроскоп» и № 2017661513 «Определение углов расположения бактерий на подложке по отношению к направлению сканирования зондового микроскопа».

6. Готовится заявка на изобретение «Экспресс-способ оценки антибиотикорезистентности бактерий».

7. Готовится методическое пособие по лабораторной работе, демонстрирующее разработанный способ, для учащихся физико-математической школы Тюменской области и студентов Тюменского государственного университета.

Выводы

1. Установлено, что статистически достоверный результат можно получить в течение всего 2-х часов, когда первый час уходит на сканирование образца с контрольным образцом, а второй – на сканирование образца, подверженному воздействию антибиотика. Полученный результат позволяет говорить о принципиальной возможности разработки экспресс-способа определения антибиотикорезистентности бактерий.

2. Достоверный результат на чувствительность штамма бактерии к выбранному антибиотику получают быстрее существующего метода бактериального посева, на который требуется от 1 до 7 дней.

Перспективы использования результатов работы

Разработанный экспресс-способ на основе метода их параллельного расположения позволит в кратчайшие сроки провести оценку антибиотикорезистентности бактерий.