Использование метода регистрации светорассеяния для изучения агрегации белков

Актуальность

Многие лекарственные средства используют белок как основной активный компонент. Например, люди, больные диабетом, используют внутримышечные инъекции белка инсулина для поддержания нормального количества сахара в крови. Однако белкам свойственно в неблагоприятных условиях денатурировать и образовывать агрегаты. Зачастую они образуются внутри клеток. Известно много заболеваний, которые вызываются накоплением агрегатов внутри клеток (болезнь Паркинсона, катаракта и др.). В клетках за поддержание нативной структуры белка отвечают белки-шапероны. В то же время для фармацевтики важной задачей является разработка способов поддержания исходной структуры белка in vitro.  Чтобы изучать влияние разных веществ на подавление агрегации, необходимо наладить инструментальные способы количественного измерения агрегации белковой молекулы. Поэтому важно сравнить и наладить более достоверный из выбранных способов измерения агрегации, в том чиcле in vitro.

Цель

Наладить метод измерения агрегации модельного белка-субстрата in vitro.

Задачи

1. Изучить литературу, посвящённую механизмам и способам регистрации агрегации белков.

2. Приготовить растворы модельного белка субстрата – лизоцима.

3. Измерить агрегацию лизоцима, вызванную восстановлением дисульфидных связей при добавлении ДТТ, при помощи флуориметра CaryEclipse.

4. Измерить агрегацию лизоцима, вызванную восстановлением дисульфидных связей при добавлении ДТТ, используя школьный цифровой датчик турбидиметр (мутнометр) Relab.

5. Сравнить используемые в работе методы и наладить наиболее точный из них.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Пластиковые пробирки 1,5 мл

• Кюветы для флуориметра

• Автоматические дозаторы переменного объёма со сменными наконечниками

• Флуориметр CaryEclipse

• Цифровой датчик мутности (турбидиметр, или мутномер) Relab

• Пластиковые кюветы 3 мл

• Штатив

• Водный термостат

• Воздушный термостат

• Реактивы (дигидрофосфат натрия моногидрата, лизоцим из белка куриных яиц – Fluka, ДТТ)

Описание

В работе использовали метод регистрации агрегации белка по светорассеянию при 340 нм. Измерения проводили на флуориметре CaryEclipse.

В начале работы автор приготовил пробы белка, содержащие разное количество лизоцима.
Следующий этап – измерение денатурации белка в растворе двумя разными приборами.

Один прибор (флуориметр CaryEclipse) измерял светорассеяние при длине волны в 342 нм, другой (турбидиметр) – при 940 нм. Условия регистрации светорассеяния: t = 37 °С, λ возбуждающего света = 340 нм, λ регистрирующего света = 342 нм, щели монохроматоров = 2,5 нм, усиление на фотоэлектроумножителе = 600 V, интервал записи 0,2 мин = 12 сек. Для достижения и поддержания температуры 37 °C в начале эксперимента подогревали кюветку в водном термостате. Однако для измерений приходилось постоянно вынимать кювету из термостата и только затем помещать в кюветное отделение датчика мутности. Позже нашли другой способ, используя воздушный термостат – инкубатор. Таким образом, получилось достичь максимально точных результатов, так как актуальные данные начали получать постоянно.

Через 5 минут после начала записи светорассеяния в кюветы добавляли индуктор денатурации лизоцима – дитиотреитол (ДТТ) и регистрировали агрегацию белка.

Результаты

1. Налажен метод агрегации модельного белка-субстрата лизоцима, индуцирующий восстановление дисульфидных связей дитиотреитолом (ДТТ).

2. После добавления к раствору лизоцима ДТТ до конечной концентрации 10 мМ, структура белка стала разрушаться. Произошло помутнение раствора внутри кюветы, а на графике виден рост интенсивности светорассеяния.

2. Получены кривые агрегации лизоцима, измеренной по светорассеянию при 340 нм на флуориметре. Данный метод является очень чувствительным. Рекомендуемая концентрация лизоцима 0,3 мг/мл.

3. Наибольшее светорассеяние наблюдалось в кювете с наибольшей концентрацией лизоцима.

Выводы

Датчик мутности Relab пригоден для регистрации агрегации белков, однако отсутствие термостатируемой ячейки является существенным недостатком прибора. Данный метод является менее чувствительным, так как при длине волны 940 нм невозможна регистрация светорассеяния больших агрегатов белка.

Перспективы использования результатов работы

Полученные результаты можно использовать для исследований агрегации белков и взаимодействий их с белками-шаперонами.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФИЦ Биотехнологии РАН

Мнение автора

«Был доволен получить положительную оценку от экспертов за проделанный труд. Большая работа, которая научила меня не только работе в лаборатории, но и познакомила с миром научных публикаций. «Старт в медицину» – отличный шанс для школьников познакомиться и влиться в исследовательскую жизнь учёных и не только. Благодаря этому конкурсу я с огромным удовольствием буду продолжать свой путь к научным открытиям»