Экспрессное профилирование жирных кислот в плазме крови человека методом масс-спектрометрии МАЛДИ

Актуальность

Свободные жирные кислоты являются важным источником энергии для большинства тканей тела, они также участвуют в таких процессах, как передача сигналов рецептора, экспрессия генов и регуляция системного гомеостаза. В связи с этим детектирование таких соединений в биологических жидкостях человека и его тканях приобретает большое значение для ранней диагностики заболеваний и мониторинга их лечения.

Цель

Провести тестирование матричных соединений для выбора матрицы, наиболее подходящей для детектирования свободных жирных кислот в крови человека.

Задачи

1. Провести анализ научной литературы для определения наиболее перспективных и доступных матричных соединений.

2. Зарегистрировать масс-спектры МАЛДИ модельных жирных кислот для определения матричного соединения, обеспечивающего наилучшую эффективность десорбции/ионизации аналитов.

3. Провести апробацию предложенных матричных соединений на реальном образце (работы, связанные с непосредственным обращением к образцам крови, выполнялись сотрудниками сторонней организации).

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Масс-спектрометр Bruker autoflex speed

Описание

Среди методов, используемых при анализе свободных жирных кислот, наибольшей чувствительностью и избирательностью обладают подходы на основе масс-спектрометрии. В большинстве случаев применяется масс-спектрометрия с ионизацией электронами в сочетании с газовой хроматографией, также используется масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией. Недостатком этих подходов являются относительно сложные процедуры пробоподготовки и значительное время, необходимое для проведения анализа. Альтернативой этим методам может являться масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией (МАЛДИ), обеспечивающая быструю регистрацию масс-спектра и не подверженная матричным эффектам. Использование этого подхода осложнено необходимостью подбора матричных соединений, которые могут обеспечивать десорбцию/ионизацию аналитов.

Масс-спектры МАЛДИ получали на масс-спектрометре Bruker autoflex speed, оснащённом твёрдотельным УФ-лазером с λ = 355 нм, в режиме регистрации отрицательно заряженных ионов с использованием рефлектона.

Для регистрации масс-спектров МАЛДИ в роли матриц были взяты 3-аминохинолин, 9-аминоакридин, акридин, 1,8-ди(N,N-диметиламино)нафталин. В качестве стандартов для проведения сравнения матричных соединений использовали декановую, тетрадекановую и гексадекановую кислоты. В качестве растворителя взяли тетрагидрофуран (ТГФ).

Пробоподготовка стандартов для регистрации их масс-спектров МАЛДИ проводилась путём смешивания 10 мкл раствора аналита (2 мг/мл в ТГФ) с 30 мкл раствора матрицы (10 мг/мл в ТГФ). При определении пределов обнаружения процедура пробоподготовки не менялась, однако концентрация раствора аналита менялась путём его двухкратного разбавления. Полученная смесь наносилась на мишень МТР 384 ground dteel (Bruker Daltonics Inc.), которую оставляли на открытом воздухе до испарения растворителя.

Отбор, пробоподготовка образца крови и нанесение полученных экстрактов на мишень проводилась в ООО «ХромсистемсЛаб». Эта организация обеспечила соблюдение этических стандартов. В ходе процедуры пробоподготовки 1 мл крови помещали в пробирки с активатором свёртывания и центрифугировали в течение 10 минут при 300 об/мин. Супернатант вновь отделяли, смешивали с раствором матрицы и наносили на мишень.

Результаты

1. Сначала было определено матричное соединение, наилучшим образом подходящее для детектирования жирных кислот. Анализ полученных данных показал, что во всех случаях полученные масс-спектры содержали пики ионов продуктов депротонирования кислот.

2. Определены пределы обнаружения (10^-5 мг/мл растворов аналитов) декановой (С10:0), тетрадекановой (С14:0) и гексадекановой кислот (С18:0) помощью метода масс-спектрометрии МАЛДИ с использованием 3-аминохинолина (3АХ), 9-аминоакридина (9АА), акридина (А) и 1,8-ди(N,N-диметиламино)нафталина (ДМАН) в качестве матриц.

Анализ полученных данных показал, что наилучшие результаты достигались в присутствии 1,8-ди(N,N-диметиламино)нафталина.

3. Масс-спектры представленных образцов крови, зарегистрированные в присутствии 1,8-ди(N,N-диметиламино)нафталина, содержали пики ионов свободных жирных кислот.

4. Для некоторых образцов были получены масс-спектры с использованием остальных матричных соединений, однако они не содержали соответствующих пиков ионов.

Выводы

1. Наилучшие пределы обнаружения жирных кислот достигаются в присутствии 1,8-ди(N,N-диметиламино)нафталина.

2. Использование 1,8-ди(N, N-диметиламино)нафталина в качестве матричного соединения позволяет детектировать свободные жирные кислоты в крови с минимальной пробоподготовкой.

Сотрудничество с вузом и учреждением при создании работы

1. ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов», кафедра органической химии

2. ООО «ХромсистемсЛаб»