Исследование «quorum sensing» системы психрофильных люминесцирующих бактерий aliivibrio logei

Цель

Изучить работу «quorum sensing» регуляции психрофильных люминесцирующих бактерий Aliivibrio logei. 

Задачи

1) Изучить необходимую литературу;

2) Получить цельноклеточного биосенсора на основе бактерии Escherichia coli путём трансформации клеток E. coli MG1655 биосенсорной плазмидой pSV16;

3) Провести калибровку полученного биосенсора;

4) Провести измерения зависимостей уровня люминесценции культуры клеток A. logei, оптической плотности культуры клеток

и концентрации АИ от времени инкубации;

5) Оценить скорость синтеза АИ клетками A. logei;

6) Определить пороговую концентрацию АИ, при которой включается люминесценция клеток A. logei.

Содержание работы

QS система A. logei работает поэтапно, т. е. существует две пороговые концентрации:

1) по достижении нижней пороговой концентрации АИ в клетке срабатывает регуляция и увеличивается скорость синтеза АИ;

2) по достижении второй пороговой концентрации АИ в клетке начинается экспрессия генов, отвечающих за люминесценцию.

Для культивирования клеток A. logei использовалась солёная среда SWT:

 триптон бактериологический 5 г/л,

 дрожжевой экстракт 2,5 г/л,

 глицерин 3 г/л,

 морская соль 15 г/л.

Для твёрдой среды SWT добавляли бактериологический агар

до концентрации 1,5%.

При трансформации и культивировании клеток E. coli использовали среду LB:

 триптон бактериологический 10 г/л,

 дрожжевой экстракт 5 г/л, 

 NaCl 10 г/л,

 рН 7,5.

Штамм E. coli K-12:

 MG1655 F – λ – ilvG– rfb-50 rph-1

Штаммы A. logei:

 Skal Источник: Балтийское море, Куршская Коса, сарган Belone belone, ЖКТ.

В данном исследовании были использованы следующие методы: 

1) Рассев бактерий E. coli и A. logei до отдельных колоний;

2) Посев бактерий E. сoli и A. logei в жидкую питательную среду;

3) Измерение оптической плотности (OD-optical density);

4) Трансформация бактериальных клеток E. coli плазмидной ДНК;

5) Измерение уровня интенсивности люминесценции суспензии клеток с помощью люминометров «Биотокс» и «LM01A»;

6) Измерение концентрации АИ с помощью цельноклеточного биосенсора.

В рамках данной работы было проведено исследование работы QS системы психрофильных люминесцирующих клеток A. logei Skal

с помощью цельноклеточного биосенсора на основе клеток E. coli.

Выводы

1) В клетках A. logei Skal синтез АИ и синтез люциферазы активируются при различных концентрациях АИ;

2) Первая пороговая концентрация АИ, при которой усиливается синтез АИ, по порядку равно 1 нМ;

3) При концентрациях АИ ниже первой пороговой синтез АИ идёт

с фоновой скоростью порядка 10 нМ/час в расчёте на оптическую плотность клеток, равную 1;

4) Вторая пороговая концентрация АИ, при которой активируется синтез люциферазы, по порядку равна 1-10 мкМ.

Возможно, такая сложная регуляция взаимодействия позволяет экономить ресурсы не только на люминесценции (зачем светиться, если плотность клеток недостаточна, чтобы их заметили),

но и на синтезе АИ. Ведь в данном случае АИ в фоновом режиме синтезируется с очень низкой скоростью, но очень рано начинает сам усиливать собственную продукцию