Бесскорлупное культивирование куриных яиц в условиях птицефермы. Современные методы и возможности их оптимизации

Актуальность

Бесскорлупное культивирование куриного эмбриона – это процесс развития яйцеклетки до момента получения из неё эмбриона в искусственно созданной среде при полном или частичном отсутствии защитных оболочек.

Данный метод позволяет вмешиваться в процесс развития зародыша для работы с его генетическим материалом на любом этапе развития, даёт возможность наблюдать за морфогенезом, эмбриональным поведением и ростом зародыша.

Одной из важнейших причин смертности, хронических болезней и инвалидности в детском возрасте являются пороки развития и преждевременные роды. По данным ВОЗ (2020 г.), от пороков развития в течение первых четырёх недель жизни ежегодно умирают 303 000 детей. Согласно популяционным исследованиям, проведённым в различных странах, частота встречаемости врождённых пороков развития составляет в среднем от 3 до 6 %. Это приводит к летальности в 30-40 % случаев, служит основной причиной детской смертности (до 25 %) и инвалидности (до 50 %). С помощью данной методики можно подробно изучить патогенез врождённых пороков развития, что необходимо для разработки новых методов их профилактики и лечения.

Цель

Разработать методические рекомендации для улучшения способа бесскорлупного культивирования куриного эмбриона и подобрать необходимые параметры для успешного развития зародыша.

Задачи

1. Проанализировать имеющиеся методики бесскорлупного культивирования и предложить способы их оптимизации.

2. Подготовить материально-техническое оснащение и оптимальные условия для бесскорлупного культивирования эмбриона.

3. Проанализировать полученные данные для их дальнейшей корректировки и апробации.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Инкубатор

• Оплодотворённые яйца (Бройлер Кобб 500)

• Растворы: бензилдиметил[3-(миристоиламино)пропил]аммоний хлорид моногидрат (0,01%-й раствор (Мирамистин), антисептик на водной основе, перманганат калия

• Дистиллированная вода

• Стерильные одноразовые шприцы 5 мл с иглой

• Перчатки латексные хирургические стерильные

• KISLOROD (смесь 80 % кислорода и 20 % азота)

• 70% -й раствор этанола

• Специальная подставка для яиц

• Колпачки из пищевого пластика

• Латексная подкладка

• Пинцет

• Овоскоп

Описание

В начале работы автор, используя научную литературу, изучил химический состав яйца, его строение, эмбриогенез и периодизацию развития кур, оптимальные параметры инкубации яиц. Далее были проанализировали статьи на тему бесскорлупного культивирования куриных эмбрионов.

В практической части проекта проведён ряд экспериментов с использованием различных методик бесскорлупного культивирования эмбриона (in ovo, ex ovo), с внесёнными в них корректировками. В начале инкубировали куриные яйца в скорлупе для проверки работоспособности инкубатора и подбора оптимальных параметров инкубации.

Система для культивирования куриного эмбриона представляет собой обработанный раствором перманганата калия пластиковый стакан объёмом 200 мл, в верхней части которого сформирована плёнка, принимающая вогнутую форму, напоминающую форму яйца. При этом важным моментом является отсутствие складок в структуре плёнки. В культуральном сосуде на высоте 2 см от дна находится отверстие 5-7 мм, через которое будет добавлен водный раствор Мирамистина, постепенно пополняющийся в ходе эксперимента.

За 18 часов до начала эксперимента яйца находились в помещении при температуре +25–27 °C, далее обработаны 1%-ым раствором перманганата калия в течение 5 минут, высушены и проверены в овоскопе на наличие трещин или других повреждений. Затем яйца аккуратно вскрыли, поместили в культуральные сосуды, накрыли продезинфицированной плёнкой, поместили в инкубатор при температуре +37,9 °C и влажности 75 %. Проведено два эксперимента с использованием методик ex ovo (выращивание эмбриона полностью без скорлупы) и in ovo (бесскорлупное культивирование куриного эмбриона). При использовании методики in ovo яйца изначально инкубировали в скорлупе в течение 48 часов и только затем поместили в культуральные сосуды для последующего бесскорлупного выращивания. Для предотвращения нестерильности заменили порошок глюконата кальция на его раствор в ампулах, добавили антибиотик Тилозин (0,0025 мл на одно яйцо). Все сосуды разместили под углом примерно 8 °, два раза в день их переворачивали на 120 ° по часовой стрелке каждые 12 часов. Это делалось для того, чтобы предотвратить прикрепление оболочек эмбриона к одной из стенок сосуда. По данной методике проведены 3 эксперимента с определёнными корректировками:

- исходные манипуляции;

- со стороны воздушной камеры у каждого яйца было сделано отверстие по размеру воздушной камеры;

- добавление дистиллированной воды, начиная с 6-х суток развития зародыша и изменение типа обдува инкубатора.

Результаты

1. С помощью методики ex ovo удалось добиться результата развития зародыша до 5 суток. Помутнение белка яиц может быть вызвано нестерильностью порошка глюконата кальция и отсутствием антибиотика. 

2. Максимальный показатель развития куриного эмбриона с использованием методики in ovo составил шесть суток или 28,57 % от всего времени эмбрионального развития зародыша. Предварительное инкубирование в течение 48 часов не дало ожидаемого результата. Кроме того, достаточно сложным и рискованным процессом является вскрытие уже заранее проинкубированных эмбрионов, так как велик риск повредить различные оболочки яйца. Однако важно отметить, что ни у одного из зародышей не было заметно помутнения белка, что говорит о качественной дезинфекции всего оборудования, среды и биодобавок.

3. Наилучшим результатом при добавлении со стороны воздушной камеры у каждого яйца отверстия по её размеру стало развитие эмбриона в течение 9 суток. Но есть и минусы – довольно интенсивное высыхание зародыша, поэтому необходимо создать более надёжную систему защиты вскрытого пространства на скорлупе, чтобы избежать пересыхания в верхней части.
4. Добавление дистиллированной воды, начиная с 6 суток развития зародыша, и изменение типа обдува инкубатора привели к тому, что на 20-е сутки все цыплята сделали поклёв в скорлупе и дышали за счёт воздуха инкубатора. Для облегчения вылупления мембрана постоянно смачивалась водой. На двадцать первые сутки вылупилось два цыплёнка и пятеро погибли. На двадцать вторые сутки – три цыплёнка. Разница между вылуплением первого и последнего цыплёнка составила 24 часа.

Методики бесскорлупного выращивания куриных эмбрионов ex ovo (слева) и in ovo (справа) и цыплята, полученные в ходе эксперимента

Выводы

1. Методика ex ovo не показала свою результативность в связи с большим количеством факторов, неблагоприятно влияющих на развитие эмбриона, т. к. полностью отсутствует скорлупа, которая является источником ионов кальция и выполняет защитную функцию. Поэтому очень сложно компенсировать отсутствие скорлупы, ведь не все препараты (лактат кальция, глюконат кальция) обеспечивают равномерное поступление ионов кальция, к тому же введение этих препаратов может привести к ацидозу. Полиметилпентеновая плёнка, исполняющая роль суррогатной скорлупы, недостаточно газопроницаема, что может приводить к гипоксии. Кроме того, из-за отсутствия защитного барьера между содержимым яйца и внешней средой появляется риск попадания патогенных микроорганизмов, что также непросто предотвратить даже с использованием антибиотика (тилозин, циклофосфамид, гентамицина сульфат).

2. Преимущество in ovo по сравнению методикой ex ovo заключается в том, что большая часть скорлупы сохраняется, но при этом имеется отверстие для осуществления различных манипуляций с куриным эмбрионом. Это исключает тот факт, что эмбриону не хватает веществ, находящихся в скорлупе. Уменьшается площадь поверхности соприкосновения содержимого яйца с внешней средой, что уменьшает риск попадания патогенных бактерий и предотвращает интенсивную потерю влаги. Кроме того, из-за большого количества пор повышался газообмен, но данный фактор полностью не компенсировался, и причиной гибели эмбрионов могло быть отсутствие качественной газопроницаемости суррогатной «скорлупы».

3. Аэрация кислородом с первых дней культивирования, использование специальных колпачков, добавление дистиллированной воды по мере потери яйцом влаги, изменение обдува и конвекции в инкубаторе при бесскорлупном культивировании куриного эмбриона in ovo позволило увеличить выживаемость зародыша в пренатальном периоде до 92 % и вылупление цыплят до 36 %.

Перспективы использования результатов работы

Данный проект может помочь в разработке новых методов лечения врождённых пороков развития у детей и дает возможность разработки методов вмешательства в процесс развития зародыша для работы с его генетическим материалом на любом этапе развития.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), кафедра биологии и общей генетики