Влияние ампициллина разной концентрации на живые организмы

Актуальность

В современных средствах массовой информации тема вредного воздействия антибиотиков на живые организмы поднимается постоянно, но необходимость применения их в лечении заболеваний неоспорима. Использование антибиотиков вызывает иммунитет бактерий к ним, и это затрудняет лечение многих заболеваний.

Цель

Определить влияние ампициллина на живые организмы.

Задачи

1. Изучить литературные источники по данной теме.

2. Определить влияние ампициллина разной концентрации на прорастание семян голубой фасоли и редиса.

3. Получить культуру простейших и определить действие ампициллина разной концентрации на организмы.

4. Определить приобретение бактериальной культурой Escherichia coli (E. coli) устойчивости к ампициллину.

5. Определить в ампициллине наличие функциональных групп: альдегидной, карбоксильной и амидной.

6. Разработать рекомендации по использованию антибиотиков.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Микроскоп

• Лабораторные весы

• Бактериальные штаммы E.coli XL1-Blue

• Ампициллин («Синтез», Россия)

• Компетентные клетки («Евроген», Россия)

• Плазмиды pAL2-T

• Шейкер

• Твёрдотельный термостат

• Центрифуга

• Амплификатор BioRad Е100 Termal Cycler

• Праймеры M13F и M13R

• Маркер молекулярного веса GenRuller 1 kb plus (Fermentas)

• Аппарат для электрофореза

Описание
Определение в ампициллине альдегидной, карбоксильной и амидной функциональных групп проводилось с помощью качественных реакций «серебряного зеркала», окисления с гидроксидом меди (II) и реакции с выделением аммиака.

Для определения влияния ампициллина на прорастание семян голубой фасоли и редиса в 8 чашек Петри поместили вату, смоченную 0,25%-м, 0,5%-м и 1%-м растворами ампициллина, и вату, смоченную водопроводной водой. Затем на вате разместили 20 семян фасоли и 100 семян редиса. Наблюдение проводилось в течение недели.

Определение влияния ампициллина разной концентрации на организмы проводилось на выращенной из аквариума культуре простейших. Через 2 недели под микроскопом были обнаружены инфузории.

Для трансформации клеток лабораторных штаммов E. coli XL1-Blue автор использовал готовые компетентные клетки («Евроген», Россия).

Перед трансформацией в оттаявшие компетентные клетки было добавлено 5 мкл плазмиды pAL2-T. Инкубирование проводилось 30 мин. при 0 °С, далее – «тепловой шок» в течение 2 мин. при 42 °С и инкубирование во льду 5 мин. К клеткам было добавлено 1000 мкл среды LB, они инкубировались 1 час при 37 °C в качалке Excella E24 при 150 об/мин. Центрифугировали клетки 1 мин. при 5000 об/мин. На дне был заметен осадок, жидкость слили, оставив в пробирке около 100 мкл. Затем аккуратно ресуспендировали клетки в оставшейся жидкости и высеяли шпателем на твёрдую питательную среду с ампициллином и инкубировали в термостате при 37 °С в течение 16 часов.

После этого было проведено экспресс-выделение ДНК из бактериальных клеток E. сoli.

Стерильным наконечником биомасса единичной колонии E. сoli была помещена в микропробирку с 30 мкл стерильной воды. Затем пробирку 3 мин. инкубировали при 960 °С в твёрдотельном термостате, центрифугировали 30 сек при 12000 об/мин. Полученный супернатант использовался для проведения ПЦР в качестве матрицы.

Амплификация фрагментов геномной ДНК была проведена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводили в амплификаторе с использованием праймеров M13F и M13R для обнаружения плазмиды, содержащей ген устойчивости к ампициллину.

Результаты

Образование на стенках пробирки налёта серебра указывает на наличие альдегидной группы в ампициллине. Растворение осадка голубого цвета доказало присутствие карбоксильной группы. Запах аммиака, который выделился при взаимодействии ампициллина с раствором гидроксида натрия (при нагревании), указал на то, что в составе есть амидная функциональная группа.

В начале эксперимента раствор ампициллина с небольшой концентрацией повышал и ускорял прорастание семян. Большая часть семян проросла. Но использование в дальнейшем этого раствора привело к гибели проростков. Проростки, которые поливали водой, развивались нормально. При дальнейшем поливе раствором ампициллина высокой концентрации появление проростков не наблюдалось.

При добавлении в колбу с инфузориями 0,25%-го раствора ампициллина видимых изменений не было. В 1%-м растворе ампициллина движение простейших практически прекратилось.

Выводы

1. Наличие функциональных групп в ампициллине можно доказать качественными реакциями.

2. Концентрация ампициллина 0,25% увеличивает скорость прорастания семян голубой фасоли и редиса.

3. 1% -й раствор ампициллина вызывает гибель простейших и гибель семян голубой фасоли и редиса.

4. Бактериальная культура E. coli приобретает устойчивость к ампициллину после трансформации плазмидой, содержащей ген устойчивости к ампициллину (rAmp).

Перспективы использования результатов работы

Результаты работы помогут расширить знания об антибиотиках и их влиянии на живые организмы.

Сотрудничество с учреждением при создании работы

ФГБНУ ВНИИСБ

Мнение автора

«Я считаю, что проделала работу, которая сможет обогатить знания людей об антибиотиках, в особенности – об ампициллине. Проект «Медицинский класс в московской школе» даёт большие возможности учащимся московских школ в выборе профессии. Я благодарна конференции «Старт в медицину» за предоставленную возможность участия и полученный незабываемый опыт»