Анализ влияния кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток костного мозга на течение токсического поражения печени при действии парацетамола

Актуальность

Развитие острой печёночной недостаточности (ОПН) вследствие применения лекарственных средств – актуальная проблема современной медицины во многих странах мира. Это обусловлено неправильным и бесконтрольным приёмом ряда общедоступных препаратов, одним из которых является парацетамол (ПЦ). При приёме препарата в дозах, превышающих допустимые, его активный метаболит NAPQI связывается с клеточными белками, что приводит к гибели гепатоцитов за счёт их окисления. В свою очередь массовая гибель клеток печени вызывает активацию и миграцию в паренхиму печени гранулоцитов-нейтрофилов, которые также могут способствовать гибели клеток за счёт продуцирования активных форм кислорода (АФК). 

В настоящее время перспективным методом лечения ОПН является введение мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в зону поражения. Исходя из последних литературных данных, положительный эффект МСК вызван паракринными факторами, которые выделяют клетки. МСК вырабатывают цитокины, способные запустить регенерацию клеток за счёт взаимодействия с рецепторами на этих клетках. Таким образом, изучение влияния кондиционной среды МСК на течение токсического поражения печени и системной воспалительной реакции является актуальной задачей.

Цель

Изучить влияние кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток (КС МСК) костного мозга на течение токсического поражения печени на фоне передозировки ПЦ и на функциональную активность нейтрофилов.

Задачи

1. Проанализировать влияние КС МСК костного мозга на регенерацию гепатоцитов при токсическом действии ПЦ на лабораторных животных по результатам гистологических исследований ткани печени и уровню цитолитического фермента АЛТ.

2. Проанализировать влияние КС МСК костного мозга на функциональную активность нейтрофилов, полученных при моделировании асептического воспаления в брюшной полости у лабораторных животных.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Программа Microsoft Excel

Описание

Работа была выполнена в лаборатории химических и биотехнических синтезов МФТИ.

Автор работы использовал:

– результаты биохимических показателей крови лабораторных животных (АЛТ) и снимки гистологических препаратов ткани печени, полученные в ходе эксперимента при моделировании ОПН от введения токсических доз ПЦ;

– результаты хемилюминесцентного анализа (Ха) нейтрофилов перитонеального экссудата лабораторных животных и периферической крови, полученных при моделировании асептического воспаления в брюшной полости у лабораторных животных.

Сначала провели анализ результатов измерения уровня цитолитического фермента аланинаминотрансферазы и снимков гистологических препаратов ткани печени лабораторных животных (оценивались морфологические изменения паренхимы печени). Для оценки выраженности некротических и дистрофических изменений в ткани печени лабораторных животных был применён полуколичественный визуальный метод. Для оценки площади поражения паренхимы ткани печени была применена морфометрическая сетка Автандилова.

Для оценки функциональной активности нейтрофилов проанализировали графики хемилюминесцентного анализа (Ха) нейтрофилов перитонеального экссудата и показателей периферической крови мышей, основанного на хемилюминесценции (ХЛ). Анализировались кинетические параметры ХЛ ответа, такие как скорость развития ответа (tg угла, возникающего при наклоне кривой), амплитуда кривой (наибольшее отклонение от положения равновесия) и суммарная продукция АФК, позволяющая оценить функциональную активность нейтрофилов. В качестве активатора лаг-периода (период, предшествующий дыхательном взрыву) реакции был использован бактериальный пептид N-формил-Met-Leu-Pht (fMLF), активирующий рецепторы, сопряжённые с ГТФ-связывающим белком.

Для обработки полученных данных применялся статистический метод с использованием программы Microsoft Exсel. Статистические сравнения проводили с помощью критерия Манна-Уитни. Вероятность допустимой ошибки (p) бралась <0,05.

Результаты

1. Введение КС МСК костного мозга вызывало достоверное снижение уровня цитолитического фермента АЛТ по сравнению с контролем на 75% в первые 4 часа и на 50% в течение первых суток. На 4-е сутки: снижение АЛТ в 4 раза по сравнению с контрольной группой.

2. При анализе снимков гистологических срезов было отмечено, что через 4 часа в контрольной группе наблюдался максимальный уровень повреждения паренхимы печени.

Анализ морфологических изменений паренхимы печени при введении КС МСК костного мозга на фоне действия ПЦ

3. Соотношение лимфоцит/нейтрофил в крови интактных животных составило 2:1. В контрольной группе через 5 часов после введения зимозана соотношение снизилось до 1:8. У животных опытной группы, которым на фоне зимозана вводили фракцию КС МСК костного мозга, соотношение составило 1:1.

Таким образом, внутрибрюшинное введение КС МСК костного мозга снижает не только миграционную активность нейтрофилов в очаг воспаления, но и угнетает общую воспалительную реакцию в организме животного, что проявляется по реакции крови на воспаление.

4. При анализе результатов хемилюминесценции нейтрофилов в периферической крови животных опытной группы интегральный уровень продукции АФК был снижен в ответ на введение зимозана. 1 – запись ответа цельной крови на введение зимозана контрольной и опытной группе за 4 часа до измерения; 2 – изменение суммарной продукции АФК в ответ на введение зимозана у животных опытной группы.

5. Продукция АФК в нейтрофилах, изолированных из очага воспаления перитонеальной полости, различалась в исследуемых группах животных. Ответ клеток на fMLF в опытной группе животных был значительно ниже по сравнению с ответом клеток контрольной группы животных. Скорость развития ответа (наклон), амплитуда и продукция АФК опытной группы были значительно ниже, чем ответ контрольной группы.

1 – контроль, 2 – КС.

6. Анализ кинетических кривых показал достоверное отличие между контролем и опытной группой по продукции (ХЛ и tg угла наклона кривой), что характеризует ферментативную активность NADPH комплекса.

Выводы

1. Анализ гистологических данных показал, что КС МСК костного мозга достоверно снижает степень повреждения печёночной ткани при действии парацетамола.

2. КС МСК костного мозга снижает активность нейтрофилов, чем защищает организм от токсического действия парацетамола. 

Перспективы использования результатов работы

Полученные данные можно использовать для дальнейшего изучения паракринных факторов КС МСК на патогенез воспалительных реакций при различных патологических состояниях.

Сотрудничество с вузом при создании работы

МФТИ