Изучение влияния компонентов клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae на фибриллизацию инсулина

Актуальность

Фибриллярные белки образуют структурные элементы клеток и внеклеточного матрикса. Хорошо известной патологической формой белковых отложений являются амилоиды. На сегодняшний день описано около 25 различных типов амилоидозов, поражающих человека и животных. Одна из форм амилоидоза может сопровождать сахарный диабет II типа. При этом выработанный клетками инсулин фибриллизуется и теряет способность выполнять свою функцию. Изучение влияния компонентов клеточной стенки пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae (в частности, белка с амилоидными свойствами Bgl2P) на фибриллизацию инсулина и, следовательно, развитие сахарного диабета II типа у человека и животных является актуальной задачей.

Цель

Выяснить, происходит ли в присутствии компонентов клеточной стенки пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae фибриллизация инсулина.

Задачи

1. Провести анализ научной литературы по теме работы.

2. Приготовить смеси для проведения инкубации инсулина с возможными индукторами фибриллизации.

3. Провести инкубацию полученных смесей в течение недели при комнатной температуре без качания.

4. Приготовить пробы для электронной микроскопии с тиофлавином на основе полученных препаратов.

5. Изучить влияние клеточных стенок дрожжей S.cerevisiae и их экстрактов на фибриллизацию инсулина с помощью флуоресцентной микроскопии.

6. Проанализировать полученные результаты и сформулировать выводы.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Набор оборудования для выращивания клеток

• Шейкер

• Спектрофотометр Cary

• Центрифуга

• Микроскоп Axiovert 200M LSM510 META

• Сканирующий электронный микроскоп JEOL JSM

• Химическая посуда

• Химические реагенты

Описание

Работа выполнялась на базе кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.
В исследовании были использованы следующие штаммы S. cerevisiae:
1. BY4742 Mat α; his3∆1; leu2∆0; lys2∆0; ura3∆0 (Invitrogen) – далее wt;
2. BY4742 с делецией гена BGL2 Mat α; his3∆1; leu2∆0; lys2∆0; ura3∆0; bgl2::URA3 – далее ∆bgl2.
Для выращивания дрожжей были использованы две среды: YNB (Yeast Nitrogen Base) и YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose). Просмотр и фотографирование клеток производили на сканирующем электронном микроскопе (JEOL JSM).
Этапы работы:
1. Выделение клеточных стенок дрожжей. Клетки дрожжей разрушали на шейкере с помощью стеклянных шариков баллотини в растворе 0.05 М калий-фосфатного буфера, рН 8.0, в присутствии 5 мМ PMSF и 5 мМ ЭДТА, при охлаждении на льду. Количество клеточных стенок оценивали, измеряя оптическую плотность на спектрофотометре при 540 нм.
2. Получение водного экстракта клеточных стенок дрожжей. Экстракт отделяли от клеточных стенок центрифугированием.
3. Приготовление инкубационной смеси с инсулином. К препарату инсулина (инсулин «НовоРапид», ООО «Ново Нордиск», Россия) добавляли потенциальные индукторы фибриллизации, полученные из дрожжей S.cerevisiae штаммов wt и ∆bgl2. В качестве контрольного препарата использовали смесь инсулина с водой. Конечный объём инкубационной смеси составлял 100 мкл и содержал 10 мкл препарата инсулина. Все препараты инкубировались при комнатной температуре в течение недели.

4. Приготовление препаратов для микроскопии. На предметное стекло наносили 6 мкл инкубационной смеси, добавляли тиофлавин до конечной концентрации 25 мкМ, перемешивали, накрывали покровным стеклом, закрепляли с помощью воска. Визуализацию препаратов осуществляли на конфокальном микроскопе при длине волны возбуждающего света 488 нм (аргоновый лазер) через фильтр LP505 (пропускает свет длиной волны больше 505 нм) в лаборатории конфокальной микроскопии Центра коллективного пользования МГУ им. М. В. Ломоносова. Автор рассмотрел следующие препараты: препарат «инсулин с водой», препарат «инсулин с клеточными стенками дрожжей S.cerevisiae дикого типа (wt) и типа ∆bgl2», препарат «инсулин с водным экстрактом из клеточных стенок дрожжей S.cerevisiae дикого типа (wt) и типа ∆bgl2», препарат «инсулин с клеточными стенками дрожжей S.cerevisiae дикого типа (wt) и типа ∆bgl2, проэкстрагированными в воду». После микроскопического исследования был проведён анализ полученных данных.

Результаты

Препараты анализировали на конфокальном микроскопе, что позволяло наблюдать как флуоресценцию тиофлавина, так и структуры, видимые в проходящем свете.

1. Препарат «контроль». На препарате можно видеть, что метка распределена по фону, значит, инсулин не образует β-структур, способных связываться с тиофлавином. В проходящем свете не видны оптически плотные образования. Таким образом, используемый в работе препарат инсулина не образует видимых фибриллярных структур.

Препарат инсулина с водой: А – флоуресценция, Б – проходящий свет

2. Препарат «инсулин с клеточными стенками дрожжей S. cerevisiae дикого типа (wt) и типа ∆bgl2 (проходящий свет)». Видны небольшие круглые структуры. Однако они не являются фибриллярными образованиями, вероятно, это артефакт.

3. На препаратах, содержащих потенциальные индукторы фибриллизации, также не было обнаружено фибриллярных структур ни с помощью флуоресцентной метки, ни в проходящем свете.

Выводы

При выбранных автором условиях – времени инкубации и концентрациях потенциальных индукторов – фибриллизации инсулина не наблюдается. Компоненты клеточных стенок ни штамма wt, ни штамма ∆bgl2 не оказывают влияния на фибриллизацию инсулина.

2. Малые количества компонентов клеточных стенок дрожжей S. cerevisiae не являются факторами риска развития сахарного диабета II типа.

3. Вспомогательные вещества, содержащиеся в использованном препарате, могли ингибировать фибриллизацию. Поэтому вопрос, могут ли компоненты клеточных стенок индуцировать фибрилизацию инсулина в других условиях, например, после диализа препарата, требует дальнейших исследований.

Перспективы использования результатов работы
Несмотря на то что в результате исследования было выявлено, что малое количество компонентов клеточных стенок не вызывает фибриллизацию инсулина, сам факт проявления амилоидных свойств белками клеточных стенок S. cerevisiae даёт почву для продолжения исследований в данной области уже при иных условиях и параметрах.

Сотрудничество с вузом при создании работы

МГУ имени М. В. Ломоносова, кафедра молекулярной биологии биологического факультета.

Мнение автора

«Подготовка к конференции «Старт в медицину» стала для меня удивительной возможностью получения опыта работы в лаборатории, позволила стать более уверенным в выборе профессионального пути»