Исследование чувствительности и специфичности экспрессии мРНК онкомаркера TRF1 при раке щитовидной железы

Актуальность

Злокачественные опухоли – классические приложения задач классификации: симптомы проявляются тогда, когда болезнь запущена до неизлечимости, а надёжные тесты крайне дорогие, поэтому востребованы более дешёвые и менее надёжные тесты.

Статистика показывает, что пик заболеваемости приходится на 45–60 лет, но болезнь может возникнуть и в более раннем возрасте, поэтому важно как можно раньше обнаружить её, чтобы не допустить образования опухолей, которые могут привести к летальному исходу.

Цель

Определить эффективность онкомаркера TRF1 и построить ROC-кривую на основе полученных данных.

Задачи

1. Провести анализ теоретических источников, описывающих роль онкомаркера TRF1.

2. Провести ОТ/ПЦР для гена TRF1 с целью определения уровня экспрессии его мРНК.

3. Провести электрофорез продуктов ОТ/ПЦР, окрасить и сфотографировать гели после электрофореза.

4. Провести статистическую обработку результатов исследования.

5. Провести ROC-анализ для исследования диагностической ценности онкомаркера.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Программы Oligo Ver.6.67 и Vector NTI; ImageJ 1.35I Quanty One v.4.4.0; Statistica v7.1  MedCalc for Windows v9

• Прибор для электрофореза

• Фотокамера Kodak

Описание

Работа включала в себя несколько этапов.

1. Проведена обратная транскрипция, в ходе которой с матрицы РНК синтезировалась ДНК (кДНК), поскольку специфические РНК являются индикаторами экспрессии соответствующих генов, а метод ПЦР проводится только с ДНК.

2. Полученную кДНК амплифицировали методом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, специфичных первичной структуре кДНК исследуемых генов.

Нуклеотидные последовательности генов были взяты из базы данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Проверку геноспецифичности праймеров осуществляли при помощи программ Oligo Ver.6.67 и Vector NTI. Места посадки праймеров для амплификации кДНК должны находиться в разных экзонах, тогда они будут специфически гибридизоваться с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК, а длина продукта ПЦР, амплифицированного с примесной геномной ДНК, будет значительно больше длины ожидаемого продукта ПЦР, амплифицированного с кДНК.

3. Проведен электрофорез продуктов ОТ/ПЦР в 1,5%-ом (для р53, RelA, TRF1, COX-2, MMP-7) или 2%-ом (для с-Мус) агарозных гелях, содержащих 0,5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве электрофорезного буфера использовали 1хTBE. При анализе экспрессии гена hTERT электрофорез проводили в 1,8%-ом агарозном геле с последующей окраской геля раствором красителя SYBR Green I (разведённого деионизованной водой 1:10000) в течение 40 мин при комнатной температуре и в темноте. Образцы вносили в лунки геля в объёме 10 мкл.

4. Гели снимали на цифровую фотокамеру Kodak и проводили анализ изображений на компьютере с помощью программ ImageJ 1.35I и Quanty One v.4.4.0. Уровни экспрессии исследуемых генов нормализовали по отношению к уровню экспрессии конститутивного гена (β-актина), который приняли за единицу. Уровень экспрессии исследуемого гена ниже 0,15 отн. ед. расценивали как очень низкий, от 0,15 до 0,29 отн. ед. – низкий, от 0,3 до 0,54 отн. ед. – средний, от 0,55 до 0,99 отн. ед. – высокий, выше 1 отн. ед. – очень высокий (гиперэкспрессия).

5. Полученные данные обрабатывали с помощью стандартных методов вариационной статистики, при этом соблюдали общие рекомендации для медицинских и биологических исследований. Для оценки диагностической значимости потенциальных онкомаркеров вычисляли чувствительность, специфичность, точность, прогностичность положительного и отрицательного результатов, отношение правдоподобия положительного (ОППР) и отрицательного результатов (ОПОР), отношение шансов диагностического теста (ОШДТ) по общепринятым в медицине. В качестве одного из наиболее полных и современных методов оценки информативности диагностического теста использовали ROC-анализ. Информативность диагностического теста определяется тем, насколько высоко лежит его характеристическая кривая. Диагностическая эффективность каждого из онкомаркеров (или качество модели, предсказательная способность, информационная ценность теста) оценивалась по общепринятой экспертной шкале для значений AUC.

Для построения диагностической модели был применён логистический регрессионный анализ. Выбор онкомаркеров для включения в данную модель осуществлялся на основе анализа ассоциаций зависимого признака с каждым из независимых с помощью метода Кендэла.

Результаты

Площадь под кривой (AUC) равна 0,841. При значении «Cut-off»<0,83 специфичность анализа экспрессии TRF1 составляет 95,1 %, чувствительность – 53,9 %. При значении «Cut-off»<0,9391 – специфичность – 69,23 %, чувствительность – 82,93 %.

Чем ближе площадь под кривой AUC к площади квадрата (условно принятую за 1), тем эффективнее диагностический тест. Чем ближе кривая к диагонали, тем ниже эффективность диагностического метода. Диагональ соответствует полной неразличимости здоровых и больных изучаемым методом. Чем выше показатель AUC, тем качественнее классификатор, при этом значение 0,5 демонстрирует непригодность выбранного метода классификации (соответствует случайному гаданию).

Вывод

Анализ характеристической кривой для онкомаркера TRF1 показал, что фактор TRF1 обладает очень хорошей диагностической эффективностью (согласно экспертной шкале для значений AUC) у больных различными заболеваниями щитовидной железы, в том числе и аутоиммунными.

Перспективы использования результатов работы

Ген TRF1 может использоваться в качестве онкомаркера.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)