Влияние эндогенных активных форм кислорода на репродуктивную систему дрозофилы

Актуальность

Активные формы кислорода (АФК) могут оказывать как физиологическое, так и патологическое действие на организм. Часть АФК продуцируются при помощи фермента NADPH-оксидазы Duox. В регуляции образования АФК принимают участие многие ферменты и витамины. В нашей работе мы изучаем влияние эндогенных АФК на репродукцию плодовой мушки Drosophila melanogaster, а также влияние различных доз витамина С и Е на данный процесс.

Цель

Выяснить, как отсутствие NADPH-оксидазы Duox сказывается на формировании половой системы и гамет дрозофилы.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

• Центрифуга
• Спектрофотометр
• Дозаторы
• Мухи линии Curly и мухи линии Oregon
• Гомогенизатор
• Гомогенат
• Фосфатный буфер
• Соляная кислота
• Тиобарбитуровая кислота
• Перекись водорода

Описание

На линиях мух с мутацией CyO, которых содержали на кормах с разным количеством витаминов С и Е, а также в условиях экспериментального окислительного стресса, вызванного присутствием в корме солей кадмия автором было установлено, что витамины С и Е не влияют на продолжительность жизни дрозофилы; витамин С не снижает негативное действие окислительного стресса, а витамин Е делает его воздействие не таким разрушающим. Внесение дополнительных доз аскорбиновой кислоты также не влияло и на плодовитость. Однако при внесении витамина Е наблюдалось незначительное, но достоверное снижение плодовитости в линии CyO. При этом на фоне окислительного стресса в линии мух с мутацией CyO также происходило снижение плодовитости, но оно было не столь значительным, как в линии дикого типа OR. Автором также  было установлено, что снижение плодовитости происходило из-за снижения активности каталазы в семенниках и яичниках. Чтобы определить, как различные экспериментальные условия влияют на активность свободно- радикальных процессов в половой системе дрозофилы, автор  оценивал уровень содержания малонового диальдегида (участвует в перекисном окислении липидов) и активность каталазы (одного из главных антиоксидантных ферментов) в семенниках и яичниках мух. Для этого через пять дней после выхода из куколки автор препарировал мух, извлекал семенники и яичники и гомогенизировал их в 1 мл фосфатного буфера (PBS). Далее проводил центрифугирование при 2000 об/мин 5 минут для осаждения крупных фрагментов органов. На одно определение брал по 30 пар семенников или 20 пар яичников. Затем использовал 300 мкл гомогената для определения активности каталазы и 700 мкл гомогената для определения содержания малонового альдегида. Для определения активности каталазы к образцам автор добавлял 1,8 мл 10 мМ раствора перекиси водорода (опыт) или такое же количество дистиллированной воды (холостая проба). Снижение оптической плотности в результате расщепления перекиси водорода в опытной пробе измерял против контроля каждые 30 с в течение 3 мин при комнатной температуре при длине волны 230 нм. При расчёте активности автор  использовал средние значения изменения оптической плотности за каждую минуту в течение 3 мин. Полученные значения выражал в ммоль Н2О2/мин.

Определение концентрации малонового диальдегида (МДА) автор проводил следующим образом: к образцу добавлял 0,6 М раствор HCl и 0,06 М раствор тиобарбитуровой кислоты, после чего инкубировал образец в течение 60 минут при 95 градусах. В качестве контрольной пробы использовал образец, где лизат был заменен дистиллированной водой. Полученную оптическую плотность при длине волны 532 нм использовал для расчета содержания МДА в образце.

Таким образом, полученные результаты указывают на важность свободно-радикальных процессов на ранних этапах гаметогенеза дрозофилы.

Результаты работы/выводы

1. NADPH-оксидаза Duox играет важную роль на ранних этапах оогенеза дрозофилы.
2. При наличии высоких доз витамина Е на фоне мутации CyO происходит снижение плодовитости мух.
3. NADPH-оксидаза Duox может выступать как в качестве продуцента АФК, так и быть акцептором свободных радикалов. Этот эффект зависит от дозы гена.
4. Duox участвует в регуляции распределения белка Oscar в яйцевых камерах дрозофилы по неизвестному пока механизму.
5. Чрезмерное употребление антиоксидантов может негативно сказаться на репродуктивной системе.

Перспективы использования результатов работы

Многие гены дрозофилы имеют гомологичные гены у человека, и далее можно говорить о ранее не известных механизмах участия АФК в функционировании репродуктивной системы человека.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

Линии дрозофилы и реактивы предоставлены Институтом Биологии Гена РАН.

Награды/достижения (в каких конкурсах и с какими результатами выставлялась ранее эта работа)

«Старт в медицину» - призер.

Мнение автора

«Благодаря Курчатовскому проекту я обрела много новых навыков. Я смогла поработать в научном мире, научилась работать со статьями и приобрела бесценный опыт»