Определение CRISPR-последовательностей на примере бактерий и архей

Актуальность работы

Проблемой современной генетики является направленное редактирование конкретных генов, не затрагивающее другие гены. Прорывным открытием в этой области стало описание иммунной системы защиты бактерий CRISPR-Cas. Система легла в основу методики, позволяющей вырезать участок ДНК и на его место вставлять новый.

Гипотеза

Во всех изучаемых нами геномах можно обнаружить CRISPR-системы.

Цель

Поиск CRISPR-системы в геномах прокариот и изучение метода CRISPR-Cas.

Задачи

• Изучить особенности генома прокариот.
• Раскрыть особенности CRISPR-системы.
• Проанализировать геном некоторых бактерий и архей на наличие CRISPR-систем.

Описание работы

CRISPR − это англоязычная аббревиатура (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), т. е. это короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами в геномах бактерий и архей. CRISPR-системы состоят из геномных кассет, в которые записывается информация о вирусных болезнях, Cas-белков, обеспечивающих молекулярный механизм иммунитета, прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными спейсерами (последовательностями).

Методы исследования:

Анализ, сравнение и обработка информации, представленной на сайтах.

1. Национальный центр биотехнологической информации (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/);
2. Базы данных, разработанные Université Paris-Sud и представленные на сайте: http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/;
3. Программа CRISPR finder tool;
4. Flanking sequence Alignement Tool;
5. Онлайн-сервис CRISPRTarget;
6. Базы данных, разработанные новозеландским University of Otago: http://bioanalysis.otago.ac.nz/CRISPRTarget/crispr_analysis.html.

Для проведения исследований нами были выбраны в качестве модельных образцов 8 бактерий и 2 археи.

1. Синегнойная палочка (лат. Pseudomonas aeruginosa);
2. Helicobacter pylori;
3. Пневмококк (лат. Streptococcus pneumoniae);
4. Золотистый стафилококк (лат. Staphylococcus aureus);
5. Кишечная палочка (лат. Escherichia coli);
6. Lactobacillus acidophilus;
7. Сенна́я па́лочка (лат. Bacillus subtilis);
8. Myxococcus xanthus;
9. Pyrococcus horikoshii;
10. Pyrococcus furiosus.

Исходные нуклеотидные последовательности геномов бактерий и архей для последующего анализа были взяты с сайта Национального центра биотехнологической информации (NCBI). Затем для анализа генома на наличие CRISPR-последовательностей и сравнения полученных результатов с аналогичными системами мы использовали онлайн-программы и базы данных, разработанные Université Paris-Sud. В частности, для поиска CRISPR-последовательностей в геноме мы использовали программу CRISPR finder tool, сравнение расчётных CRISPR-последовательностей и спейсерных повторов проводили в открытой базе данных лидерных последовательностей, для поиска гомолога локуса CRISPR или в случае проверки сомнительной CRISPR-последовательности мы пользовались инструментом Flanking sequence Alignement Tool.

Для оценки степени устойчивости бактерий и архей к чужеродным генетическим элементам мы определяли комплементарные последовательностям спейсеров CRISPR-системами к участкам протоспейсеров фагов. Идентификацию фагов со спейсерными последовательностями проводили с помощью онлайн-сервиса CRISPRTarget и баз данных, разработанных новозеландским University of Otago.

Результаты

Из восьми рассмотренных нами модельных бактерий у четырёх нет CRISPR-систем.

У остальных четырёх бактерий есть CRISPR-системы, но у трёх из них есть только единичные CRISPR-системы. Факт связан с тем, что у этих бактерий выработан иммунитет против самых распространённых фагов и вирусов. Самой необычной из рассмотренных бактерий оказалась хищная бактерия Myxococcus xanthus. У неё оказалась самое большое количество CRISPR-систем из всех рассмотренных нами бактерий и огромное число спейсерных массивов, противостоящих различным фагам. Такое количество CRISPR-систем привело к существенному разрастанию генома этой бактерии. Из этого следует, что у бактерии иммунная система выработана от патогенов, от антибиотиков, от своих фагов, от фагов других бактерий, которыми она питается. А также её иммунная система способна регулировать рост плодовых тел и передвижение по почве. В отличие от бактерий у обеих архей из нашего списка, как и предполагалось, оказалось много CRISPR-систем. Из этого следует, что иммунной системе архей гораздо проще увеличить свой спейсерный массив, нежели искать другие способы защиты от вирусов и фагов.

Выводы

1. Проведено исследование геномов нескольких бактерий и архей на наличие в них CRISPR-последовательностей.

2. Установлено, что количество CRISPR-систем у прокариот зависит от условий обитания и изменчивости окружающей среды.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

Компьютер с доступом к интернету.

Награды/достижения

1-е место на межрайонном этапе Московского городского конкурса проектных и исследовательских работ в МРСД 20.

Сотрудничество с вузом при создании работы

-

Перспективы развития результатов работы

Метод редактирования генома CRISPR-CAS имеет очень большую ценность. Важное значение для биотехнологий имеет создание штаммов технологически значимых бактерий. Можно отредактировать геном с помощью CRISPR-Cas у многих животных. Например, у свиней редактирование генома позволит пересаживать органы свиньи человеку. Редактирование генома у насекомых и простейших позволит избавиться от многих, в том числе и смертельных, заболеваний: малярия, токсоплазмоз, тропические лихорадки и другие. Технология CRISPR-Cas успешно применяется в генной инженерии растений. С помощью редактирования генома можно создать у растений противовирусный и противобактериальный иммунитеты. Методы, основанные на CRISPR-Cas, могут найти применение и в медицине для лечения самых разнообразных заболеваний: вирусных, аллергических и иммунологических, онкологических, сердечно-сосудистых, а также наследственных расстройств. Возможно на стадии эмбриона редактировать также генетические заболевания.

Особое мнение

-