Моноклональные антитела как современный подход к изучению вируса гепатита C

Актуальность

Вирус гепатита С (ВГС) является одной из наиболее актуальных проблем современности. Это заболевание имеет широкую распространенность: по данным ВОЗ хронической инфекцией гепатита С страдают около 70 миллионов человек во всем мире и примерно 399 000 человек ежегодно умирают от этого заболевания. Именно поэтому, изучение белков ВГС имеет огромное значение для диагностики и лечения данного заболевания.      

Одним из методов исследования является иммуноферментный анализ (ИФА), ключевыми реагентами которого являются моноклональные антитела (МКА). Моноклональные антитела — это класс антител, которые обладают высокой селективностью в отношении молекулярной мишени (конкретному эпитопу антигена), являющейся, как правило, одним из ключевых компонентов патологического процесса. В основу реакции положено классическое взаимодействие антигена с антителом.

Цель

Изучение свойств МКА 3F11 и 6B11 к рекомбинантному неструктурному белку rNS4 ВГС.

Задачи

1. Определить эффективность работы моноклонального антитела 3F11 (по сравнению с 6B11) методом ИФА.
2. Определить возможность его использования в исследованиях, направленных на изучение рекомбинантного неструктурного белка rNS4 ВГС.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

• Рекомбинатный белок NS4
• Мышиные моноклональные антитела
• Конъюгат (козьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена)
• Субстрат
• Стоп-реагент
• Казеин для разведения
• PBS×1 (однократный соляной буфер)
• PBSTw20 (соляной буфер с содержанием твина-20 в концентрации 0,1 %)
• Микропланшет
• Многоканальный семплер
• Термостат
• Микропланшетный спектрофотометр (ИФА-ридер)

Описание

1. Сорбция рекомбинантного белка.

Рекомбинантный белок rNS4 засорбировала в разведении 1:500{2} и 1:2000{1} для 3F11 и 1:500{2} 6B11 по 50 мкл/лунку 96-луночного микропланшета с использованием PBSх1 (однократного фосфатно-соляного буфера).
              Инкубация проводилась при комнатной температуре в течение ночи.

2. Отмывка после сорбции.

Отмывка необходима для удаления несвязавшихся компонентов и проводилась путем внесения PBSTw20 (фосфатно-соляного буфера с содержанием твина-20 в концентрации 0,1%) в объеме 250 мкл/лунку. Панель отмывала вручную в течение 3 мин, затем содержимое лунок сбрасывала. Процедуру повторяла 4 раза.

3. Титрование и внесение моноклональных антител 6B11 и 3F11
4. Инкубация

Проводилась при температуре +37°C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывался крышкой для предотвращения испарения и кантаминирования.

5. Повторная отмывка

Необходима для удаления первичных антител, не связавшихся с антигенами.

6. Внесение конъюгата.

В качестве конъюгата я использовала вторичные козьи антитела, соединённые с пероксидазой хрена в разведении 1:500 по 50 мкл/лунку с использованием казеина.

7. Инкубация

Проводилась при температуре +37°C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывался крышкой.

8. Отмывка несвязавшихся вторичных антител.
9. Внесение субстрата.
10. Инкубация

Проводилась при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.

11. Внесение стоп-реагента по 50 мкл/лунку.
12. Учет результатов на микропланшетном анализаторе.

Для определения рабочей концентрации МКА 6B11 и 3F11 были построены графики с помощью программы Microsoft Excel.

Результаты работы/выводы

1. Результаты по МКА 6В11 в разведении 10 мкг/мл являются более достоверными, чем результаты по МКА 3F11 в том же разведении, поэтому эффективней использовать МКА 6B11.
2. Это дает основание говорить о том, что в лабораторной и клинической практике для обнаружения белка NS4 ВГС в дальнейшем будет применяться моноклональное антитело 6B11.

Перспективы использования результатов работы

Возможность дальнейшего использования моноклонального антитела МКА 6В11 в фундаментальных исследованиях, направленных на борьбу с вирусом гепатита С.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина.

Награды/достижения (в каких конкурсах и с какими результатами выставлялась ранее эта работа)

«Курчатовский проект — от знаний к практике, от практики к результату» — призёр.

XXIX Всероссийская конференция одаренных школьников "Авангард" – диплом 3 степени.

Мнение автора

«Работа помогла на практике познакомиться с методом иммуноферментного анализа, освоить некоторые приемы и получить навыки лабораторных исследований»