Выявление онкологических и нейродегенеративных заболеваний по флуоресцентному определению катехоламинов и их метаболитов в биологических жидкостях

Актуальность работы

Одной из актуальных задач современной аналитической химии является разработка чувствительных, селективных, экспрессных и простых методик определения маркеров нейродегенеративных и нейроэндокринных заболеваний в биологических объектах, таких как кровь, моча, спинномозговая жидкость, цитоплазма клетки.

Цель

Разработка и внедрение в практику экспресс-методик определения катехоламинов (КА) – дофамина, эпинефрина и норэпинефрина – в биологических жидкостях по флуоресценции их комплексов с европием(III) и окситетрациклином (ОТЦ).

Задачи

• Сравнить методики определения маркеров нейродегенеративных заболеваний в биологических объектах.
• Изучить литературу по существующим методикам определения.
• Выбрать наиболее перспективную методику определения катехоламинов в биологических жидкостях.
• Подобрать оптимальные условия для проведения реакции в системе Eu³⁺- ОТЦ-КА: выбрать буфер и pH, ПАВ, время проведения реакции, соотношение реагентов в комплексе Eu³⁺- ОТЦ.
• Определить константу устойчивости комплекса Eu³⁺- ОТЦ.
• Апробировать разработанную методику.
• Изучить влияние компонентов в биологических жидкостях, мешающих флуоресцентному определению катехоламинов.

Описание работы

Катехоламины и их метаболиты могут выступать в качестве молекулярных маркеров при диагностике болезни Альцгеймера и Паркинсона: по снижению их содержания в биологических жидкостях можно судить о начале заболевания. Трудность определения катехоламинов в биологических жидкостях обусловлена тем, что у здорового человека их концентрации изначально очень низки – на уровне 1 нМ, а при различных патологических нарушениях в ряде случаев они снижаются ещё на порядок, поэтому работа имеет практическую значимость.

Этапы выполнения работы

1. Подбор оптимального комплекса взаимодействия ОТЦ с катехоламинами и ионом Eu³⁺.

2. Оптимизация условий проведения индикаторной реакции.

3. Выбор природы и pH буферного раствора: как удалось определить, оптимальным по воспроизводимости и интенсивности сигнала является буферный раствор на основе 0.01 М MOPS, рН 7,5.

4. Выбор соотношения концентраций Eu³⁺:ОТЦ: оптимальным соотношением концентраций Eu³⁺:ОТЦ по интенсивности и воспроизводимости сигналов поглощения и флуоресценции является 1:1.

5. Выбор природы и концентрации ПАВ: наиболее интенсивный сигнал флуоресценции наблюдали при использовании Tween 80 с концентрацией 10^-2 М.

6. Формирование и вывод оптимальных условий формирования флуоресцентного комплекса Eu³⁺– ОТЦ–КА.

7. Расчёт условной константы устойчивости комплекса Eu³⁺– ОТЦ.

8. Апробация на примере получения результатов определения норэпинефрина в плазме крови крыс.

Результаты

1. Разработана индикаторная система для определения катехоламинов.

2. Выбраны условия регистрации флуоресцентного сигнала и условия проведения определения катехоламинов.

3. Рассчитана условная константа устойчивости комплекса Eu³⁺- ОТЦ.

4. В выбранных условиях разработаны флуоресцентные экспресс-методики определения дофамина, эпинефрина, норэпинефрина в полистирольном планшете

по реакции комплексообразования их с ионом европия (III) и окситетрациклином.

5. Продемонстрирована принципиальная возможность определения катехоламинов и их метаболитов в биологических жидкостях.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

- Микропипетки «Biohit» и «Eppendorf» (отбор малых объёмов р-ров);

- pH-милливольтметр «Hanna Instruments» (измерение pH буферных растворов);

- Аналитические весы «OHAUS»;

- Секундомер «Агат» (фиксация времени индикаторной реакции);

- Спектрофотометр «UV-mini 1240 Shimadzu» (регистрация спектров поглощения);

- Спектрофлуориметр «Cary Eclipse Agilent» (измерение интенсивности флуоресценции и спектров испускания);

- Кварцевая микрокювета (измерение спектров поглощения и флуоресцентного сигнала);

- 96-луночные полистирольные планшеты.

Награды/достижения

Диплом II степени – Московский городской конкурс проектных и исследовательских работ-2019.

Сотрудничество с вузом при создании работы

Часть практики проводилась в лаборатории химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Перспективы развития результатов работы

1. Подобрать улучшенные условия для определения содержания катехоламинов в биологических жидкостях.

2. Проанализировать интенсивность флуоресценции.

3. Улучшить процедуру экспресс-диагностики и прогностики заболеваний по анализу крови.

Особое мнение

«Курчатовский проект в московской школе – это уникальная возможность окунуться в мир науки, используя современное научно-технологическое оборудование. Конференция «Курчатовский проект – от знаний к практике, от практики к результату» – это не только представленные школьные уникальные проекты высокого уровня, но и увлекательные лекции от ведущих специалистов НИЦ «Курчатовский институт». Очень здорово, что каждому московскому школьнику предоставляется возможность участия в таких конференциях»