Проекты

Разработка сорбента для аффинной хроматографии на основе пептидомиметиков

Работа победителя открытой городской научно-практической конференции «Наука для жизни» в секции «Органическая химия» среди работ учащихся 10−11 классов

Направление работы: Органическая химия, Биотехнология, Методы очистки белковых препаратов
Авторы работы: ГБОУ Школа им. А. Боровика
Предметы: Биология, Химия
Классы: 10 класс
Мероприятия: Открытая городская научно-практическая конференция «Наука для жизни» 2020 года

Актуальность

Персонализированная медицина – перспективный метод раковой терапии. Одно из её направлений – изучение метаболизма опухолевых клеток и использование её ферментов и рецепторов как терапевтической мишени. Рак предстательной железы – самое распространённое онкологическое заболевание среди мужчин на территории России, поэтому остро стоит вопрос о поиске новых методов его лечения. Заболевание сопровождается гиперэкспрессией Простат-специфического мембранного антигена (фермента Глутаматкарбоксипептидазы II), который и является маркером рака. Если выделить и очистить фермент, получив его высокоочищенный препарат, это позволит проводить анализы ex vivo при разработке лекарств, направленных на ингибирование метаболизма клеток раковой опухоли предстательной железы.

Цель

Разработка сорбента и метода иммобилизации пептидомиметика для аффинной хроматографии ферментов.

Задачи

  1. Разработать и провести серию модельных реакций для подтверждения или опровержения возможности модификации сорбента на основе моносахарида ПСМА-лигандом
  2. Осуществить сборку полноценного сорбента и оценить возможность его применения в аффинной хроматографии

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

  • Роторный испаритель
  • Мембранный насос
  • Аналитические весы
  • Пипетки автоматические
  • Лампа УФ
  • Вытяжной шкаф
  • Ультразвуковая баня
  • Насос пластинчато-роторный
  • Ультразвуковой дезинтегратор
  • ЯМР-спектрометр
  • Хроматографическая колонка.

Описание

Целью автора было разработать аффинный сорбент. Обычно он имеет три компонента: матрицу, в этом случае – агарозный гель (полимерный углевод агароза в форме сфер, помещённых в буфер), спейсер (автор выбрал аминокапроновую кислоту) – это длинная молекула, которая обеспечивает доступность лиганда и сам лиганд (пептидомиметик ПСМА-лиганд), отвечающий за селективное взаимодействие сорбента и фермента.

Экспериментальная часть работы:

I.       Модельные реакции

1.      Моно-модификация галактозы эпихлоргидрином

В качестве первого фрагмента спейсера был выбран эпихлогидрин: гидроксильные группы галактозы были замещены оксирановыми циклами.

Реакция протекала при нагревании в тетрагидрофуране в присутствии водной щёлочи и межфазового катализатора тетрабутиламмоний бромида.

Для перевода остатков брома в соль NaBr в реакционную смесь ввели 40 %-ный раствор гидроксида натрия по массе.

2.      Модификация галактозы остатком ε-аминокапроновой кислоты

Далее необходимо было удлинить спейсерную группу и ввести на периферию молекулы карбоксильную группу для дальнейшего присоединения ПСМА-лиганда путём создания пептидной связи. Катализатор трифлат кальция позволил ускорить эту реакцию.

3.      Модификация галактозы ПСМА-лигандом

Заключительный этап модельных реакций и самая интересная часть практического модуля. Для модификации галактозы ПСМА-лигандом путём создания пептидной связи автор выбрал метод активированных эфиров. Реакция серьёзная, поэтому проводилась под чутким контролем научного руководителя. Самая главная задача – соблюсти порядок добавления реагентов, иначе не избежать большого количества побочных продуктов реакции.

По завершении каждого этапа модификации автор проверял структуру полученного вещества методом ЯМР-спектроскопии и очищал продукт реакции от примесей с помощью колоночной хроматографии. А за ходом самих реакций автор следил с помощью тонкослойной хроматографии.

На модели было показано, что модификация реализована, при этом возможно регулировать количество пришиваемых лигандов. Разработанная методика была успешно применена для сборки аффинного сорбента на основе агарозного геля. К сожалению, с учётом возможностей автора, судить об успешности модификации агарозного геля представлялось возможным только благодаря микроскопу: сферы поэтапно увеличивались в объёме, что косвенно подтверждает успешность синтеза.

Автор участвовал в постановке реакций, сборке и подготовке реакционных установок, снятии ЯМР-спектров. Очистка промежуточных соединений также проводилась автором.

Результаты работы/выводы

  1. Разработан и реализован модельный эксперимент по модификации углеводной составляющей (галактозы) пептидомиметиком ПСМА-лигандом
  2. Подобраны оптимальные условия очистки промежуточных соединений. Для синтезированных соединений с близкой хроматографической подвижностью оптимально использовать систему растворителей этилацетат/изопропиловый спирт/вода
  3. Проведена модификация агарозного геля согласно отработанной методике, получен аффинный сорбент для аффинной хроматографии фермента Глутаматкарбоксипептидазы II

Перспективы использования результатов работы      

Предполагаются дальнейшие исследования зависимости структура/активность (работоспособности) полученного модифицированного сорбента методом иммуноферментного анализа. При наличии успешных результатов данного исследования разработанный сорбент можно будет применять в аффинной хроматографии для выделения фермента Глутаматкарбоксипептидазы II. Теоретически такие факторы, как размер частиц сорбента, пространственная доступность ПСМА-лиганда благодаря спейсеру и выбор оптимальной подвижной фазы способствуют хорошему связыванию сорбента с ферментом, а значит, выделению без повреждений и качественной очистке Глутаматкарбоксипептидазы II.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

Работа выполнялась на базе Технопарка «Альтаир»

Награды/достижения

Конференция «Инженеры будущего» – призёр