Проекты

Исследование белка WBSCR2

Работа призёра открытой городской научно-практической конференции «Наука для жизни» в секции «Нанотехнологии. Теоретические и фундаментальные исследования. Математика и механика» среди работ учащихся 10−11 классов

Направление работы: Биохимия
Авторы работы: ГБОУ Школа имени Маршала В.И. Чуйкова
Предметы: Химия
Классы: 11 класс
Мероприятия: Открытая городская научно-практическая конференция «Наука для жизни» 04−05 апреля 2019 года

Актуальность

Работа посвящена изучению белка WBSCR27, ассоциированного с синдромом Вильямса. Это заболевание вызвано делецией участка из 26 генов на седьмой хромосоме человека.

Одним из отсутствующих генов является WBSCR27, кодирующий одноимённый белок, активность которого изучается в настоящем исследовании.

Ранее было обнаружено, что белок WBSCR27, содержащийся в эукариотических организмах, может катализировать реакцию отщепления аденина, как это происходит у прокариот, что не может делать ни один из ранее известных ферментов эукариот, поэтому изучение свойств этого белка является перспективным исследованием.

Цель работы: исследование свойств белка WBSCR27.

Задачи

1. Проверка способности белка катализировать отщепление аденина от аналогов Sаденозил-L-гомоцистеина (SAH) с использованием одномерной ЯМР спектроскопии.

2. Идентификация сайта связывания SAH с белком с использованием двумерной гетероядерной спектроскопии на 15N-меченом белке.

3. Создание модели сайта связывания с помощью компьютерного моделирования.

4. Выделение субстрата метилирования.

Содержание работы

В качестве аналогов SAH были выбраны следующие соединения: метилтиоаденозин (MTA), 5’дезоксиаденозин (5’dAdo), аденозин (Ado) и S-аденозил-L-метионин (SAМ). Реакции проводили в одинаковых условиях в присутствии буферного раствора в течение 5 дней при температуре 35 °С, периодически регистрируя спектры ЯМР. Выяснилось, что за период наблюдений реакция с МТА полностью прошла, реакция с 5’dAdo прошла не полностью, реакция с аденозином не прошла, а в процессе реакции белка с SAM наблюдался процесс расщепления SAM c образованием МТА, а также отщепления аденина от МТА или SAM. На следующем этапе работы была выполнена идентификация сайта связывания. Для этой цели мы использовали 2D-гетероядерную спектроскопию ЯМР на ядрах 1Н и 15N, N, что позволило обнаружить аминокислоты, участвующие в связывании ко-фактора. Полученные данные об аминокислотах, входящих в сайт связывания, были использованы для создания 3D-модели комплекса белок-лиганд с помощью метода молекулярного докинга в программе Haddock. Эта программа позволяет работать с экспериментальными данными и представляет несколько возможных структур. Для выделения субстрата потенциальной метилтрансферазы мы решили использовать азид-алкиновое циклоприсоединение модифицированного биотина с последующим выделением модифицированного субстрата с помощью стрептавидиновой смолы. Известно, что метилтрансферазы способны переносить не только метильную, но и некоторые другие группы с модифицированной молекулы SAM на субстрат. Поэтому производное SAM с тройной связью на замещённой группе позволило бы переместить эту группу на субстрат и выделить его. Для этой цели мы синтезировали (E)-1-бромо-4-(проп-2-ин-1-илокси)бут-2-ен. Мы также пытались синтезировать 1-бромогекс-2-ен-5-ина, пропаргил-SAM, гомопропаргилSAM, но за время наблюдения реакции не успели пройти полностью: видимо, требуются изменения условий проведения реакции.

Выводы

1) Белок WBSCR27 катализирует отщепление аденина от SAH и его аналогов − MTA и 5'dAdo, однако не катализирует аналогичную реакцию с аденозином.

2) В белке WBSCR27 идентифицирован сайт связывания ко-фактора методом двухмерной спектроскопии ЯМР (1H-15N 2D HSQC).

3) Синтезирован (E)-1-бромо-4-(проп-2-ин-1-илокси)бут-2-ен, необходимый для синтеза аналогов SAM, содержащих терминальную тройную связь