Проекты

Создание растений-биосенсоров на тяжелые металлы

Работа призёра открытой городской научно-практической конференции «Курчатовский проект – от знаний к практике, от практики к результату» в секции «Поиск» среди работ учащихся 10−11 классов

Направление работы: Генная инженерия
Авторы работы: ГБОУ Школа № 1449
Предметы: Биология
Классы: 11 класс
Мероприятия: Открытая городская научно-практическая конференция «Курчатовский проект – от знаний к практике, от практики к результату» 2020 года

Актуальность

Работа посвящена созданию растения, вырабатывающего флуоресцентный белок в ответ на загрязнение почвы тяжелыми металлами.

Актуальность работы определяется тем, что загрязнение почв тяжелыми металлами выходит на первое место среди всех видов загрязнений как по количественным показателям, так и по опасности для окружающей среды, и получение растительного маркера, отвечающего на загрязнение синтезом флуоресцентного белка, поможет вовремя диагностировать проблему и предотвратить ее последствия.

Цель

Реализация первого этапа, а именно - создание генетического инструментария, который позволит осуществить перенос требуемых генов в растительный геном.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

Оборудование лаборатории геномной инженерии МФТИ

  • Оборудование лаборатории геномной инженерии МФТИ
  • Спектрофотометр
  • Центрифуга
  • Амплификатор
  • Качалка для культивирования
  • Ламинарный бокс
  • Лабораторное оборудование и материалы

Описание

Процесс создания целевой генетической конструкции можно разделить на два этапа:

  1. Дизайн конструкции in silico.
  2. Создание конструкции с применением методов молекулярной биологии.

Для работы автор выбрала бинарный вектор на основе плазмиды pCambia. В данном векторе уже находится ген флуоресцентного белка ZsGreen под контролем конститутивного промотора 35S вируса мозаики капусты. Она решила заменить исходный промотор на prCdI19, который расположен на пятой хромосоме в геноме растения Arabidopsis thaliana. Нуклеотидную последовательность данного промотора взята из базы данных NCBI (accession number CP002688). Во время дизайна конструкции автор продумала ход эксперимента: выбрала праймеры для клонирования и скрининга конструкций, подобрала рестриктные сайты.

На первом этапе она выделила геномную ДНК Arabidopsis thaliana, которую далее использовала для наработки фрагмента ДНК, содержащего промоторную область CdI19. Дальше она провела полимеразную цепную реакцию (ПЦР), используя праймеры, выбранные ранее (prCdl19 F HindIII, prCdl19 R KpnI), которые содержали на концах рестриктные сайты HindIII и KpnI, необходимые в дальнейшем для рестрикции. В результате ПЦР автор получила продукт, который отмечен на схеме (в тексте работы) как Amplified CdI19. При прямом клонировании амплифицированных вставок в большие плазмидные векторы (размерами более 10kb) часто возникают проблемы, поэтому автор решила сначала поместить данный промотор в небольшую плазмиду pSL1180 (3,4kb).

Далее она провела реакцию рестрикции для ампликона и вектора pSL1180 по указанным рестриктным сайтам. В результате рестрикции на концах молекул формируются комплементарные липкие концы, которые затем сшиваются в реакции лигирования с образованием новой конструкции pSL1180 + CdI19. Реакционной смесью после завершения лигирования она трансформировала бактериальные клетки E.coli штамм XL1-Blue, полученные одиночные колонии проверили на наличие целевой конструкции с помощью праймеров M13 F и M13 R. Затем нарастила бактериальные клетки и выделила плазмидную ДНК. Данный этап необходим для наработки в больших количествах нужной плазмиды, поскольку реакция лигирования протекает с низкой эффективностью. Выход целевых конструкций крайне мал, чтобы продолжать манипуляции без этапа наработки плазмид в живых клетках.

Потом автор провела реакцию рестрикции для выделенных плазмид, вырезав prCdI19 по рестриктным сайтам HindIII и KpnI. Также с помощью рестрикции она удалили промотор 35S из конструкции pCambia 35S-ZsGreen. Полученные фрагменты сшила в реакции лигирования с образованием конструкции pCambia prCdI19-ZsGreen. Автор трансформировала бактериальные клетки E.coli штамм XL10-Gold реакционной смесью после лигирования, полученные клетки она проверила на наличие нужной  конструкции. Затем она нарастила бактериальные клетки на жидкой среде и выделила ДНК. Выделенную ДНК автор анализировала с помощью секвенирования по Сэнгеру. Данный метод позволяет точно определить последовательность нуклеотидной цепи. Полученная автором последовательность полностью соответствует ожидаемой, не было замен, вставок или делеций нуклеотидов.

Весь объем работы был выполнен непосредственно автором.

Результаты работы/выводы

Создана генетическая конструкция, которая позволит получить генетически модифицированные растения способные к индуцибельной экспрессии флуоресцентного белка в присутствии соединений тяжелых металлов.

Перспективы использования результатов работы

В дальнейшем планируется генетически трансформировать растение методом агробактериальной трансформации с использованием нашего инструментария и изучить свойства полученных растений.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

МФТИ, Лаборатория геномной инженерии.

Мнение автора

«Я очень признательна, что смогла поучаствовать в этой конференции. Я получила новый опыт, который поможет мне в моей будущей научной деятельности. Я была рада получить мнение о моем исследовании от экспертов. В ходе работы я узнала очень много о генной инженерии, получила навыки работы в научной лаборатории со сложными приборами и я хотела бы работать в этой области в будущем. Моя работа – это не просто интересный опыт. Он может помочь решить проблему загрязнения почвы, что важно для будущего нашей планеты»