Проекты

Повышение эффективности амплификации ДНК методом ПЦР с использованием термостабильной пирофосфатазы

Работа призёра открытой городской научно-практической конференции «Курчатовский проект – от знаний к практике, от практики к результату» в секции «Поиск» среди работ обучающихся 8–9 классов

Направление работы: Молекулярная биология
Авторы работы: ГБОУ Школа № 627
Предметы: Биология, Химия
Классы: 9 класс
Мероприятия: Открытая городская научно-практическая конференция «Курчатовский проект – от знаний к практике, от практики к результату» 2020 года

Актуальность

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо амплификации ДНК ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики наследственных и инфекционных заболеваний, установления отцовства, клонирования генов, выделения новых генов.

ПЦР протяжённых фрагментов (Long-distance PCR, лонг-дистанс ПЦР, то есть способность амплифицировать протяжённые участки ДНК-матрицы) – ПЦР, благодаря которой осуществляется синтез длинных фрагментов ДНК (до 5–10 тыс. п. н. и более). В таких случаях для проведения ПЦР обычно используют термостабильные ДНК-полимеразы либо две различные ДНК-полимеразы.

При этом крайне важно получить полноразмерный фрагмент протяжённого участка ДНК. Поскольку осуществление лонг-дистанс ПЦР наталкивается на определённые сложности, крайне важным является выявление особенностей протекания этой реакции. Именно поэтому автором для проекта выбрана такая актуальная тема, как «Повышение эффективности амплификации ДНК методом ПЦР с использованием термостабильной пирофосфатазы».

Цель

Сравнительный анализ повышения эффективности амплификации протяжённых участков ДНК на примере ДНК фага лямбда методом ПЦР в зависимости от концентрации праймеров, рН и ионной силы реакционного буфера и наличия термостабильной пирофосфатазы.

Задачи

  1. Отработать оптимальные условия амплификации протяжённых участков ДНК фага лямбда методом ПЦР.
  2. Выявить условия эффективного протекания лонг-дистанс ПЦР в зависимости от концентрации праймеров, pH и ионной силы реакционного буфера.
  3. Выяснить влияние термостабильной пирофосфатазы на эффективность амплификации протяжённого фрагмента ДНК фага лямбда методом лонг-дистанс ПЦР.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

  • Лабораторный блок для проведения ПЦР
  • Резиновые перчатки
  • Вытяжка с опущенной стеклянной шторкой
  • Цифровая фотокамера в системе гель-документирования Syngene G:BOX
  • Программное обеспечение GeneTools 4.3.8.
  • Микроволновая печь
  • Навеска агарозы
  • Буферный раствор
  • Бромистый этидий
  • Фермент Tet Z-DNA polymerase

Описание

Для проведения лонг-дистанс ПЦР использован фермент Tet Z-DNA polymerase, выделенный из термофильной бактерии штамма Termus Thermophilus KTP. Фермент Tet Z-DNA polymerase не является рекомбинантным ферментом, а является нативным бактериальным ферментом. На первом этапе проведены исследования влияния концентрации праймеров в реакционной среде на выход специфического ПЦР-продукта. Установлено, что наибольший выход ПЦР-продукта наблюдался при концентрации праймеров в реакционной среде 0,3 мкМ. Проведено исследование влияния ионной силы и pH реакционной среды на выход ПЦР-продукта. Определено, что наибольший выход продукта ПЦР наблюдался при значении ионной силы, равном 0,08.

При использовании значения ионной силы реакционной смеси, равного 0,08, оптимальное значение рН реакционной среды составило 8,8.

После проведения оптимизации концентрации пар праймеров ионной силы реакционной смеси и рН реакционного раствора проведена ПЦР-амплификация фрагментов ДНК фага лямбда различной длины.

Результаты работы/выводы

  1. Выявлены оптимальные условия проведения ПЦР: концентрация праймеров в реакционной среде 0,3 мкМ; ионная сила, равная 0,08; pH = 8,8 (при ионной силе, равной 0,08).
  2. В данных условиях автором проамплифицирован участок ДНК протяжённостью 8457 п. н.
  3. Выявили, что пирофосфат ингибирует термостабильную ДНК-полимеразу, а пирофосфатаза позволяет снизить это ингибирование и повысить выход протяжённого ПЦР-продукта (5700 н. п.).

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова