Проекты

Повышение эффективности амплификации ДНК методом ПЦР с использованием термостабильной пирофосфатазы

Работа призёра открытой городской научно-практической конференции «Курчатовский проект – от знаний к практике, от практики к результату» в секции «Поиск» среди работ учащихся 8−9 классов

Направление работы: Биохимия
Авторы работы: ГБОУ Школа № 627
Предметы: Биология, Химия
Классы: 9 класс
Мероприятия: Открытая городская научно-практическая конференция «Курчатовский проект – от знаний к практике, от практики к результату» 2020 года

Актуальность

Амплификация протяжённых фрагментов ДНК необходима при исследовании структуры генов высокомолекулярных белков и их регуляторных последовательностей, полицистронных генов в оперонах бактерий. Крайне важным является выявление оптимальных условий протекания этой ДНК-полимеразной реакции. Именно поэтому для проекта была выбрана такая актуальная тема, как «Повышение эффективности амплификации ДНК методом ПЦР с использованием термостабильной Пирофосфатазы».

Цель

Сравнительный анализ повышения эффективности аплификации протяжённых фрагментов ДНК на примере ДНК фага лямбда методом ПЦР в зависимости от концентрации праймеров, pH и ионной силы реакционного буфера и наличия термостабильной пирофосфатазы.

Задачи

  1. Отработать условия амплификации протяжённых участков ДНК фага лямбда методом ПЦР.
  2. Выяснить влияние термостабильной пирофосфатазы на лонг-дистанс ПЦР.
  3. Выявить условия успешного протекания лонг-дистанс ПЦР в зависимости от типа праймеров.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

  • ПЦР-амплификатор
  • Оборудование для проведения электрофореза
  • Цифровая фотокамера в системе гельдокументирования Syngene G:BOX

Описание

Первым этапом выполнения работы стало исследование влияния концентрации праймеров на выход специфического ПЦР-продукта. Вторым этапом было исследование по влиянию на выход специфического ПЦР-продукта ионной силы и pH реакционной среды. На третьем этапе работы проводилось исследование влияния продукта ДНК-полимеразной реакции − пирофосфата на эффективность ПЦР. И в конце было проведено исследование влияния термостабильной пирофосфатазы на эффективность ПЦР.

Работа, выполненная непосредственно автором:

Навеску агарозы автор залил 1хТВЕ буфером (0,1М Борная кислота; 0,1М Трис и 2мМ EDTA). Взвесь нагревали в водяной бане при 100 °С или в микроволновой печи, до тех пор пока агароза не растворится. Затем автор охлаждал раствор до 50 °C и добавлял бромистый этидий (из водного раствора, содержащего 10 мг/мл и хранящегося при 4 °C в ёмкости тёмного стекла) до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Быстро заливал агарозу в электрофорезную камеру. Полимеризация геля проводилась автором работы при комнатной температуре в течение 30−45 мин., а затем осторожно удалялась гребёнка, и помещался гель в электрофорезную кювету. Автор добавил достаточное количество электрофорезного буфера так, чтобы гель был закрыт слоем буфера толщиной 1−2 мм. Смешивал пробы с буфером для нанесения пробы, содержащим 50−70 % глицерина, и краситель (Orange G) и вносил их в лунки геля под электрофорезный буфер. При анализе простого набора молекул ДНК в 0,5-см лунку вносилось 0,2−0,5 мкг ДНК. 

Условия проведения электрофореза: обычно бромистый этидий (0,5 мкг/мл) добавляют и в гель, и в электрофорезный буфер. В его присутствие электрофоретическая подвижность линейной двухцепочечной ДНК снижается примерно на 15 %, но зато при этом появляется возможность наблюдать за процессом разделения непосредственно под источником УФ-излучения во время или в конце разделения. Можно проводить электрофорез и в отсутствие бромистого этидия − окрашивать ДНК уже после завершения разделения. В последнем случае гель помещают в электрофорезный буфер или воду, содержащие бромистый этидий, на 45 мин. при комнатной температуре. Обесцвечивания обычно не требуется, но при определении очень малых количеств ДНК (<10 нг) лучше снизить фоновую флуоресценцию, обусловленную несвязанным бромистым этидием, выдержав окрашенный гель в 1 мМ MgSO4 в течение 1 ч при комнатной температуре. Поскольку бромистый этидий − мутаген, все манипуляции с гелями и растворами, содержащими краситель, проводились с особой предосторожностью, в перчатках и под вытяжкой с опущенной стеклянной шторкой.

Документирование и анализ цифрового изображения

Гели автор снимал на цифровую фотокамеру в системе гельдокументирования Syngene G:BOX и проводил анализ изображения на компьютере с помощью программного обеспечения GeneTools 4.3.8. Все исследования проводились под руководством сотрудника лаборатории.

Результаты работы/выводы

Наибольший выход ПЦР-продукта наблюдался при концентрации праймеров в реакционной среде 0,3 мкМ (микромоль). Изучение влияния pH реакционной среды и ионной силы на выход ПЦР-продукта показало, что наибольший его выход наблюдался при значении ионной силы, равной 0,08, и значении pH, равной 8,8. При изучении результатов мы отметили, что накопление продукта ДНК-полимеразной реакции − пирофосфата может привести к ингибированию термостабильной ДНК-полимеразы и снизить эффективность ПЦР, соответственно снизить синтез исследуемого ПЦР-продукта. Но расщепление пирофосфата в процессе ПЦР может решить эту проблему. Расщепление можно осуществить, введя в реакцию термостабильную пирофосфатазу. Добавление её в реакционную смесь позволило значительно увеличить выход специфического продукта ПЦР.

Амплификация фрагментов различной длины ДНК фага лямбда методом ПЦР, после осуществления подбора оптимальных концентраций праймеров, значений pH и ионной силы реакционной смеси, показала эффективность проведённой нами оптимизации для успешного протекания лдПЦР. Исследования по добавлению термостабильной пирофосфатазы в ПЦР-реакцию показали, что расщепление ферментом продукта ДНК-полимеразной реакции − пирофосфата приводит к снижению ингибирования термостабильной ДНК-полимеразы и повышению выхода ПЦР-продукта. Таким образом, сформулированная в начале проекта гипотеза подтвердилась. В результате проведённой работы по оптимизации условий проведения ПЦР нам удалось проамплифицировать ПЦР-фрагмент протяжённостью в 8457 пар нуклеотидов.

Основные этапы метода полимеразной цепной реакции

Лабораторный блок для проведения ПЦР

Перспективы использования результатов работы

Результаты работы показывают, что способ повысить эффективность амплификации ДНК существует, и он значительно облегчит и ускорит процессы производства и разработки новых научных введений в жизнь человека.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова, кафедра биологической химии.

Награды/достижения

Научно-практическая конференция «Курчатовский проект – от знаний к практике, от практики к результату» − призёр .

Мнение автора

«Я считаю проделанную работу прекрасным и нужным мне опытом. Я многому научилась, изучая начальную цель работы»