Проекты

Анализ эффективности амплификации протяженных участков ДНК фага лямбда методом ПЦР

Работа призера открытой городской научно-практической конференции «Курчатовский проект – от знаний к практике, от практики к результату» в секции «Поиск» среди работ учащихся 10-11 классов

Направление работы: Генетическая инженерия
Авторы работы: ГБОУ Школа № 627
Предметы: Биология
Классы: 10 класс
Мероприятия: Открытая городская научно-практическая конференция «Курчатовский проект − от знаний к практике, от практики к результату» 17 апреля 2019 года

Актуальность работы

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) протяженных фрагментов (Long-distance PCR, лонг-дистанс ПЦР, то есть способность амплифицировать протяженные участки ДНК-матрицы) — ПЦР, благодаря которой осуществляется синтез длинных фрагментов ДНК (до 5-10 тыс. п.н. и более). В таких случаях для проведения ПЦР обычно используют термостабильные ДНК-полимеразы, либо две различные ДНК-полимеразы.

При этом крайне важно получить полноразмерный фрагмент протяжённого участка ДНК. Поскольку осуществление лонг-дистанс ПЦР наталкивается на определённые сложности, крайне важным является выявление особенностей протекания этой реакции.

Гипотеза

Существует определённая концентрация термостабильной пирофосфатазы, при которой амплификация протяженных участков ДНК фага лямбда методом ПЦР будет осуществляться успешно, при этом эффективность такой амплификации будет зависеть от структуры праймеров.

Цель

Сравнительный анализ эффективности амплификации протяженных участков ДНК фага лямбда методом ПЦР в зависимости от типа праймеров и наличия термостабильной пирофосфатазы.

Задачи

  • отработать условия амплификации протяженных участков ДНК фага лямбда методом ПЦР;
  • выяснить влияние термостабильной пирофосфатазы на лонг-дистанс ПЦР;
  • выявить условия успешного протекания лонг-дистанс ПЦР в зависимости от типа праймеров.

Описание работы

Для проведения лонг-дистанс ПЦР был использован фермент Tet Z-DNA polymerase. Этот фермент выделен из термофильной бактерии штамма Thermus Thermophilus KTP. Исследования по добавлению термостабильной пирофосфатазы в ПЦР смесь показали, что пирофосфат, как продукт ДНК-полимеразной реакции, расщеплялся и не ингибировал термостабильную ДНК-полимеразу. При этом при осуществлении лонг-дистанс ПЦР также повышали рН реакционной смеси и включали в неё денатурирующие агенты.

Результаты

Амплификация с разными праймерами ДНК фага лямбда показала возможность успешного проведения лонг-дистанс ПЦР с праймерами разной структуры, при этом наиболее эффективным оказались условия, при котором в реакционную смесь вносили 0,25 нг ДНК фага лямбда и 0,25 ед. пирофосфатазы, следовательно, сформулированная в начале проекта гипотеза подтвердилась.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

  • Лабораторный блок для проведения ПЦР
  • Камера для горизонтального электрофореза
  • Цифровая фотокамера Kodak
  • ПО: ImageJ 1.351 и Quanty One v.4.4.0.

Сотрудничество с вузом при создании работы

Первый МГМУ имени И.М. Сеченова.

Перспективы развития результатов работы

Можно использовать полученные данные для проведения лонг-дистанс ПЦР.